Règlement (UE) n ° 260/2014 de la Commission du 24 janvier 2014 modifiant, aux fins de son adaptation au progrès technique, le règlement (CE) n ° 440/2008 établissant des méthodes d’essai conformément au règlement (CE) n ° 1907/2006 du Parlement européen et du Conseil concernant l’enregistrement, l’évaluation et l’autorisation des substances chimiques, ainsi que les restrictions applicables à ces substances (REACH) Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE
CELEX
32014R0260
Type
Règlement
Date
vendredi 24 janvier 2014
Résumé IA
Ce règlement met à jour les méthodes d'essai obligatoires pour les substances chimiques dans le cadre du règlement REACH, en les adaptant au progrès technique. Il modifie le règlement (CE) n° 440/2008 en introduisant de nouvelles méthodes ou en révisant les existantes, notamment pour les essais de toxicité et d'écotoxicité. Pour un professionnel du droit français, ce texte est essentiel car il impose des normes techniques actualisées que les industriels doivent respecter pour l'enregistrement et l'évaluation de leurs substances chimiques au sein de l'EEE.
Texte intégral
19.3.2014
FR
Journal officiel de l'Union européenne
L 81/1
RÈGLEMENT (UE) N o 260/2014 DE LA COMMISSION
du 24 janvier 2014
modifiant, aux fins de son adaptation au progrès technique, le règlement (CE) no 440/2008 établissant des méthodes d’essai conformément au règlement (CE) no 1907/2006 du Parlement européen et du Conseil concernant l’enregistrement, l’évaluation et l’autorisation des substances chimiques, ainsi que les restrictions applicables à ces substances (REACH)
(Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)
LA COMMISSION EUROPÉENNE,
vu le traité sur le fonctionnement de l’Union européenne,
vu le règlement (CE) no 1907/2006 du Parlement européen et du Conseil du 18 décembre 2006 concernant l’enregistrement, l’évaluation et l’autorisation des substances chimiques, ainsi que les restrictions applicables à ces substances (REACH), instituant une agence européenne des produits chimiques, modifiant la directive 1999/45/CE et abrogeant le règlement (CEE) no 793/93 du Conseil et le règlement (CE) no 1488/94 de la Commission ainsi que la directive 76/769/CEE du Conseil et les directives 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE et 2000/21/CE de la Commission (1), et notamment son article 13, paragraphe 3,
considérant ce qui suit:
(1)
Le règlement (CE) no 440/2008 de la Commission (2) définit les méthodes d’essai à appliquer pour déterminer les propriétés physicochimiques ainsi que la toxicité et l’écotoxicité des substances, aux fins du règlement (CE) no 1907/2006.
(2)
Il est nécessaire de mettre à jour le règlement (CE) no 440/2008 pour y inclure en priorité les méthodes d’essai alternatives nouvelles et actualisées qui ont été adoptées récemment par l’OCDE afin de réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins expérimentales, conformément à la directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (3) et à la directive 86/609/CEE du Conseil du 24 novembre 1986 concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives des États membres relatives à la protection des animaux utilisés à des fins expérimentales ou à d’autres fins scientifiques (4).
(3)
L’adaptation consiste en deux méthodes de détermination des propriétés physicochimiques, notamment une mise à jour de la méthode de détermination de la solubilité dans l’eau et une nouvelle méthode d’essai du coefficient de partage applicable à l’évaluation de la persistance, de la bioaccumulation et de la toxicité (PBT); quatre nouvelles méthodes et une méthode mise à jour pour la détermination de l’écotoxicité ainsi que du devenir et du comportement dans l’environnement; neuf méthodes de détermination de la toxicité et des autres effets sur la santé, dont quatre méthodes d’essai portant sur la toxicité par inhalation, à savoir trois méthodes mises à jour et une nouvelle méthode destinées à réduire le nombre d’animaux utilisés et à améliorer l’évaluation des effets, une mise à jour de la méthode d’essai concernant la toxicité orale à doses répétées sur 28 jours visant à inclure des paramètres d’évaluation de l’activité endocrine, une mise à jour de la méthode d’essai toxicocinétique applicable à la conception et à la compréhension des études toxicologiques et une mise à jour des méthodes portant sur la toxicité chronique, la cancérogénicité et l’évaluation combinée de la toxicité chronique et de la cancérogénicité.
(4)
Il convient dès lors de modifier le règlement (CE) no 440/2008 en conséquence.
(5)
Les mesures prévues par le présent règlement sont conformes à l’avis du comité institué par l’article 133 du règlement (CE) no 1907/2006,
A ADOPTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:
Article premier
L’annexe du règlement (CE) no 440/2008 est modifiée conformément à l’annexe du présent règlement.
Article 2
Le présent règlement entre en vigueur le troisième jour suivant celui de sa publication au Journal officiel de l’Union européenne.
Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre.
L’annexe du règlement (CE) no 440/2008 est modifiée comme suit:
1)
le chapitre A.6 est remplacé par le texte suivant:
«A.6. SOLUBILITÉ DANS L’EAU
INTRODUCTION
1.
La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 105 (1995) de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. Cette méthode d’essai constitue une révision de la ligne directrice 105 adoptée en 1981. S’il n’y a pas eu de modification de fond, la présentation a été remaniée. La révision s’appuie sur la méthode d’essai “Hydrosolubilité” de l’Union européenne (1).
REMARQUES PRÉLIMINAIRES
2.
La présence d’impuretés peut considérablement modifier la solubilité d’une substance dans l’eau. La présente méthode d’essai porte sur la mesure de la solubilité de substances essentiellement pures, stables dans l’eau et non volatiles. Avant de déterminer la solubilité dans l’eau, il est utile de disposer d’informations sur la substance telles que la formule développée, la pression de vapeur, la constante de dissociation et l’hydrolyse en fonction du pH.
3.
Les deux méthodes décrites dans cette méthode d’essai, la méthode par élution sur colonne et la méthode du flacon, couvrent respectivement les solubilités inférieures et supérieures à 10–2 g/l. Un essai préliminaire simple est également décrit. Il permet de déterminer approximativement la quantité de substance à utiliser dans l’essai proprement dit, ainsi que le temps nécessaire pour atteindre la saturation.
DÉFINITIONS ET UNITÉS
4.
La solubilité d’une substance dans l’eau est la concentration massique de saturation de cette substance dans l’eau à une température donnée.
5.
La solubilité dans l’eau est exprimée en masse de soluté par volume de solution. L’unité SI est le kg/m3, mais on utilise également le g/l.
SUBSTANCES CHIMIQUES DE RÉFÉRENCE
6.
Il n’y a pas lieu d’employer des substances de référence lorsqu’on étudie une substance.
DESCRIPTION DES MÉTHODES
Conditions de l’essai
7.
L’essai est pratiqué de préférence à 20 °C ± 0,5 °C. La température choisie sera maintenue constante dans toutes les parties du dispositif expérimental où elle peut avoir une influence.
Essai préliminaire
8.
Des volumes d’eau croissants sont ajoutés progressivement à environ 0,1 g d’échantillon (les solides doivent être pulvérisés), à température ambiante, dans un flacon gradué de 10 ml fermé par un bouchon en verre. Après chaque ajout d’eau, le mélange est agité pendant 10 minutes. On vérifie ensuite visuellement si l’échantillon est complètement dissous. Si des parties non dissoutes de l’échantillon subsistent après l’addition de 10 ml d’eau, l’essai se poursuit dans un flacon gradué de 100 ml. La solubilité approximative est indiquée dans le tableau 1, au-dessous du volume d’eau qui dissout complètement l’échantillon. Si la solubilité est faible, le temps requis pour dissoudre la substance peut être long et il faut attendre au moins 24 heures. Si après 24 heures la substance n’est toujours pas dissoute, il y a lieu d’attendre jusqu’à 96 heures ou de procéder à une dilution plus poussée, afin de déterminer s’il convient d’utiliser la méthode par élution sur colonne ou la méthode du flacon.
Tableau 1
ml d’eau dissolvant 0,1 g
0,1
0,5
1
2
10
100
> 100
solubilité approximative en g/l
> 1 000
1 000 à 200
200 à 100
100 à 50
50 à 10
10 à 1
< 1
Méthode par élution sur colonne
Principe
9.
Il s’agit d’éluer la substance à étudier avec de l’eau d’une microcolonne remplie d’un support inerte et préalablement revêtu d’un excès de la substance à étudier (2). La solubilité correspond au plateau de la courbe de la concentration massique de l’éluat en fonction du temps.
Appareillage
10.
L’appareil se compose d’une microcolonne (figure 1) thermostatée, reliée soit à une pompe de recirculation (figure 2), soit à un réservoir de remise à niveau (figure 3). La microcolonne contient un support inerte maintenu en place par un petit tampon de laine de verre, qui sert aussi à filtrer les particules. Divers matériaux peuvent être employés comme support: billes de verre, terre de diatomées ou autres matériaux inertes.
11.
La microcolonne représentée à la figure 1 convient au montage comportant une pompe de recirculation. Elle a un volume tampon correspondant à cinq fois le volume de son lit (les premiers cinq volumes de lit sont rejetés au début de l’expérience) et au volume de cinq échantillons (prélevés pour analyse pendant l’expérience). On peut cependant réduire le volume tampon à condition de pouvoir ajouter de l’eau au système pendant l’expérience pour remplacer les premiers cinq volumes de lit éliminés avec les impuretés. La colonne est reliée, par un tuyau en matériau inerte, à une pompe de recirculation capable de pomper environ 25 ml/h. La pompe de recirculation peut être, par exemple, une pompe péristaltique ou une pompe à membrane. Il faut veiller à ce que le matériau du tuyau n’occasionne aucune contamination et/ou adsorption.
12.
Un montage comportant un réservoir de remise à niveau est schématisé à la figure 3. Dans ce montage, la microcolonne est munie d’un robinet d’arrêt à une voie. Elle est reliée au réservoir de remise à niveau par un tube en matériau inerte et un raccord en verre rodé. Le débit du réservoir de remise à niveau doit avoisiner 25 ml/h.
Figure 1
Figure 2
Figure 3
13.
Verser environ 600 mg de matériau de support dans un flacon à fond rond de 50 ml. Dissoudre une quantité appropriée de substance à étudier dans un solvant volatil de qualité pour analyse et ajouter une quantité déterminée de cette solution au matériau support. Le solvant doit être complètement évaporé, par exemple à l’aide d’un évaporateur rotatif, sinon l’eau ne pourra pas saturer le support pendant l’élution à cause d’un effet de répartition à la surface. Faire tremper le support chargé pendant deux heures dans environ 5 ml d’eau et verser la suspension dans la microcolonne, ou bien verser le support sec dans la microcolonne déjà remplie d’eau et le laisser s’équilibrer pendant deux heures.
14.
Le chargement du support peut causer des problèmes conduisant à des résultats erronés, par exemple lorsque la substance à étudier est déposée sous forme d’huile. Ces problèmes doivent être examinés et détaillés dans le rapport.
Méthode avec une pompe de recirculation
15.
La circulation dans la colonne est amorcée. Il est recommandé d’appliquer un débit d’environ 25 ml/h, soit dix volumes de lit par heure pour la colonne décrite. Les premiers cinq volumes de lit au moins sont rejetés pour éliminer les impuretés hydrosolubles. Après quoi, on laisse fonctionner la pompe jusqu’à ce que l’équilibre soit atteint. L’équilibre est attesté lorsque l’analyse de cinq échantillons successifs donne des concentrations qui ne diffèrent pas de plus de ± 30 % de façon aléatoire. Ces prélèvements doivent être séparés entre eux par des intervalles de temps correspondant au passage d’au moins dix volumes de lit. Avec certaines méthodes analytiques, il peut être préférable de démontrer que l’équilibre est atteint à l’aide d’une courbe de la concentration en fonction du temps.
Méthode avec réservoir de remise à niveau
16.
Des fractions successives d’éluat sont recueillies et analysées suivant la méthode choisie. Les fractions du milieu de l’intervalle d’élution, là où la concentration demeure constante à ± 30 % près dans au moins cinq prélèvements consécutifs, servent à déterminer la solubilité.
17.
L’eau bidistillée est le meilleur éluant. On peut aussi utiliser de l’eau désionisée, caractérisée par une résistivité supérieure à 10 mégaohms/cm et une teneur totale en carbone organique inférieure à 0,01 %.
18.
Pour chaque méthode, l’opération est répétée en réduisant le débit de moitié. Si les résultats des deux opérations concordent, l’essai est satisfaisant. Si l’on mesure une solubilité plus élevée avec le débit inférieur, il y a lieu de continuer à diminuer le débit de moitié jusqu’à ce que deux essais successifs donnent la même solubilité.
19.
Pour chaque méthode, il faut vérifier la présence de matières colloïdales dans les fractions, par détection de l’effet Tyndall. La présence de particules fausse les résultats et l’essai doit être répété après avoir amélioré le pouvoir de filtration de la colonne.
20.
Le pH de chaque échantillon doit être mesuré, de préférence au moyen de bandelettes indicatrices spéciales.
Méthode du flacon
Principe
21.
La substance est dissoute dans l’eau (les solides doivent être pulvérisés) à une température légèrement supérieure à celle de l’essai. Une fois la saturation obtenue, le mélange est refroidi et maintenu à la température de l’essai. Il est toutefois possible de réaliser la mesure directement, à la température de l’essai, si un échantillonnage pertinent prouve que l’équilibre de saturation a été atteint. Ensuite, la concentration de la substance est déterminée par une méthode analytique appropriée (3). La solution analysée ne doit contenir aucune particule non dissoute.
Appareillage
22.
Le matériel suivant est requis:
—
verrerie et instruments courants de laboratoire,
—
dispositif pour agiter les solutions à température constante,
—
si nécessaire, une centrifugeuse (thermostatée de préférence) pour les émulsions,
—
équipement d’analyse.
Mode opératoire
23.
Évaluer la quantité de substance nécessaire pour saturer le volume d’eau voulu, à la lumière de l’essai préliminaire. Introduire l’équivalent d’environ cinq fois cette quantité dans chacun des trois récipients en verre munis d’un bouchon en verre (tubes à centrifuger, flacons, par exemple). Ajouter un volume d’eau, choisi en fonction de la méthode analytique et de la gamme de solubilité, dans chaque récipient. Les récipients sont bouchés hermétiquement et ensuite agités à 30 °C. Il convient d’utiliser un système d’agitation ou mélangeur capable de fonctionner à température constante, par exemple un agitateur magnétique combiné à un bain-marie thermostaté. Après un jour, laisser l’un des récipients s’équilibrer pendant 24 heures à la température de l’essai en l’agitant de temps en temps. Centrifuger ensuite le contenu du récipient à la température de l’essai et déterminer, par une méthode analytique idoine, la concentration de la substance dans la phase aqueuse limpide. Les deux autres flacons sont traités de la même manière après avoir été équilibrés à 30 °C pendant deux et trois jours respectivement. Si les concentrations mesurées au moins dans les deux derniers flacons ne diffèrent pas de plus de 15 %, l’essai est satisfaisant. Si les résultats obtenus avec les flacons 1, 2 et 3 tendent à croître, il est nécessaire de refaire tout l’essai en appliquant des temps d’équilibrage plus longs.
24.
L’essai peut aussi être conduit sans préincubation à 30 °C. Afin d’estimer la rapidité avec laquelle s’établit l’équilibre de saturation, des échantillons sont prélevés jusqu’à ce que la durée de l’agitation n’influence plus les concentrations mesurées.
25.
Le pH de chaque échantillon doit être mesuré, de préférence au moyen de bandelettes indicatrices spéciales.
Déterminations analytiques
26.
Il est préférable d’employer une méthode d’analyse spécifique pour la substance, de petites quantités d’impuretés solubles pouvant fausser gravement la mesure de la solubilité. Parmi les méthodes possibles, citons la chromatographie en phase gazeuse ou liquide, le titrage, la photométrie, la voltamétrie.
RÉSULTATS ET RAPPORT
Résultats
Méthode par élution sur colonne
27.
Pour chaque essai, il faut calculer la moyenne et l’écart-type sur au moins cinq échantillons consécutifs issus du plateau de saturation. Les moyennes établies à partir de deux essais pratiqués à des débits différents ne doivent pas s’écarter de plus de 30 %.
Méthode du flacon
28.
On calcule la moyenne des résultats obtenus avec chacun des trois flacons. Ces résultats ne doivent pas différer de plus de 15 %.
Rapport d’essai
Méthode par élution sur colonne
29.
Le rapport d’essai doit comporter les informations suivantes:
—
résultats de l’essai préliminaire,
—
identité chimique de la substance et impuretés (étape de purification préliminaire, le cas échéant),
—
concentration, débit et pH pour chaque échantillon,
—
moyennes et écarts-type sur au moins cinq échantillons provenant du plateau de saturation pour chaque essai,
—
moyenne d’au moins deux essais successifs,
—
température de l’eau au cours du processus de saturation,
—
méthode d’analyse,
—
nature du matériau du support,
—
chargement du support,
—
solvant utilisé,
—
toute manifestation d’instabilité chimique de la substance pendant l’essai,
—
toute information utile à l’interprétation des résultats, notamment en ce qui concerne les impuretés et l’état physique de la substance.
Méthode du flacon
30.
Le rapport d’essai doit comprendre les informations suivantes:
—
résultats de l’essai préliminaire,
—
identité chimique de la substance et impuretés (étape de purification préliminaire, le cas échéant),
—
résultats d’analyse individuels et moyenne si plus d’une valeur a été déterminée pour un même flacon,
—
pH de chaque échantillon,
—
moyenne des valeurs de différents flacons lorsque celles-ci concordent,
—
température de l’essai,
—
méthode d’analyse,
—
toute manifestation d’instabilité chimique de la substance pendant l’essai,
—
toute information utile à l’interprétation des résultats, notamment en ce qui concerne les impuretés et l’état physique de la substance.
BIBLIOGRAPHIE:
(1)
Directive 92/69/CEE de la Commission du 31 juillet 1992 portant dix-septième adaptation au progrès technique de la directive 67/548/CEE du Conseil concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives à la classification, l’emballage et l’étiquetage des substances dangereuses (JO L 383 du 29.12.1992, p. 113).
(2)
NF T 20-045 (AFNOR) (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel — Détermination de la solubilité dans l’eau des solides et liquides à faible solubilité — Méthode de l’élution sur colonne
(3)
NF T 20-046 (AFNOR) (septembre 1985). Produits chimiques à usage industriel — Détermination de la solubilité dans l’eau des solides et liquides à forte solubilité — Méthode du flacon.»
2)
le chapitre A.23 suivant est ajouté:
«A.23 COEFFICIENT DE PARTAGE (1-OCTANOL/EAU): MÉTHODE DU BRASSAGE LENT
INTRODUCTION
1.
La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 123 (2006) de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. La méthode du brassage lent a permis de déterminer avec exactitude des valeurs logarithmiques du coefficient de partage 1-octanol/eau (POE) allant jusqu’à 8,2 (1). Aussi constitue-t-elle une approche expérimentale appropriée pour la détermination directe du POE de substances fortement hydrophobes.
2.
Les autres méthodes de détermination du coefficient de partage 1-octanol/eau (POE), sont la méthode par agitation en flacon (2) et la méthode par HPLC phase inverse (3). La méthode par agitation en flacon est sujette à des artéfacts dus au transfert de micro-gouttelettes d’octanol dans la phase aqueuse. Lorsque les valeurs du POE augmentent, la présence de ces gouttelettes dans la phase aqueuse engendre une surestimation croissante de la concentration de la substance d’essai dans l’eau. Aussi l’usage de cette méthode est-il limité aux substances dont le log POE est < 4. À partir de valeurs fiables du POE directement déterminées, la deuxième méthode étalonne la relation entre le temps de rétention sur la colonne HPLC et des valeurs mesurées du POE. Il existait un projet de ligne directrice de l’OCDE permettant de déterminer les coefficients de partage 1-octanol/eau de substances ionisables (4), mais il ne doit plus être utilisé.
3.
La présente méthode d’essai a été élaborée aux Pays-Bas. La précision des méthodes décrites dans ce pays a été validée et optimisée au cours d’un essai tournant de validation auquel ont participé 15 laboratoires (5).
REMARQUES PRÉLIMINAIRES
Signification et utilisation
4.
S’agissant des substances organiques inertes, une relation très significative a été mise en évidence entre leur coefficient de partage 1-octanol/eau (POE) et leur bioaccumulation dans les poissons. De plus, une corrélation entre le POE et, d’une part, la toxicité pour les poissons et, d’autre part, la sorption de produits chimiques sur des solides tels que les sols et les sédiments, a également été démontrée. La référence (6) livre un large aperçu de ces relations.
5.
Des relations très diverses entre le coefficient de partage 1-octanol/eau et d’autres propriétés des substances intéressant la chimie et la toxicologie environnementales ont été établies. Le coefficient de partage 1-octanol/eau est ainsi devenu un paramètre fondamental dans l’évaluation des risques des substances chimiques pour l’environnement et dans la prédiction du devenir de ces substances dans l’environnement.
Champ d’application
6.
La méthode du brassage lent est censée réduire la formation de micro-gouttelettes de 1-octanol dans la phase aqueuse, ce qui écarte le problème de la surestimation de la concentration en phase aqueuse due à la présence de molécules de la substance d’essai dans ces gouttelettes. Par conséquent, la méthode du brassage lent convient particulièrement à la détermination du POE de substances dont le log POE est supposément supérieur ou égal à 5, gamme dans laquelle la méthode par agitation en flacon (2) tend à fournir des résultats fausséss.
DÉFINITION ET UNITÉS
7.
Le coefficient de partage d’une substance entre l’eau et un solvant lipophile (1-octanol) caractérise la répartition à l’équilibre de la substance chimique entre les deux phases. Le coefficient de partage entre l’eau et le 1-octanol (POE) est défini comme étant le rapport des concentrations à l’équilibre de la substance d’essai dans du 1-octanol saturé avec de l’eau (CO) et dans de l’eau saturée avec du 1-octanol (CE).
Le rapport de deux concentrations est une valeur adimensionnelle. Il est exprimé le plus souvent par son logarithme décimal (log POE). Le POE dépend de la température et les résultats rapportés doivent préciser la température de mesure.
PRINCIPE DE LA MÉTHODE
8.
En vue de déterminer le coefficient de partage, on laisse le système formé par l’eau, le 1-octanol et la substance d’essai s’équilibrer à température constante. Ensuite, on mesure les concentrations de la substance d’essai dans les deux phases.
9.
La méthode du brassage lent, proposée ici, permet de réduire les difficultés expérimentales associées à la formation de micro-gouttelettes dans la méthode par agitation en flacon. Avec le brassage lent, l’eau, le 1-octanol et la substance d’essai s’équilibrent dans un réacteur thermostaté soumis à une agitation douce. Les échanges entre les phases sont accélérés par le brassage. Ce dernier produit une légère turbulence qui favorise les échanges entre le 1-octanol et l’eau sans provoquer la formation de gouttelettes (1).
APPLICABILITÉ DE L’ESSAI
10.
La présence de substances autres que la substance d’essai risquant d’influencer le coefficient d’activité de la substance d’essai, celle-ci doit être testée à l’état pur. Il convient d’employer une substance d’essai présentant le degré de pureté le plus élevé que l’on puisse trouver dans le commerce.
11.
Cette méthode s’applique aux substances pures qui ne se dissocient ni s’associent et qui ne manifestent aucune activité interfaciale sensible. Cette méthode convient également aux mélanges. Le cas échéant, les coefficients de partage 1-octanol/eau déterminés varient en fonction de la composition chimique du mélange testé et de la composition électrolytique employée comme phase aqueuse. À condition de prendre certaines mesures supplémentaires, cette méthode peut aussi s’appliquer à des substances qui se dissocient ou s’associent (paragraphe 12).
12.
Le partage des substances sujettes à la dissociation, telles que les acides organiques et les phénols, les bases organiques et les composés organométalliques, entre l’eau et le 1-octanol comportant de multiples équilibres dans ces phases, le POE est une constante conditionnelle qui dépend fortement de la composition électrolytique (7) (8). D’où la nécessité de contrôler le pH et la composition électrolytique lors de la détermination du POE et de rapporter les valeurs de ces deux paramètres. L’évaluation de ces coefficients de partage doit être confiée à un expert. Il convient de sélectionner des valeurs de pH appropriées d’après la valeur de la ou des constantes de dissociation, afin d’établir un coefficient de partage pour chaque état d’ionisation. Les composés organométalliques doivent être testés à l’aide de tampons non complexants (8). À la lumière des connaissances actuelles en matière de chimie en phase aqueuse (constantes de complexation et de dissociation), on choisira des conditions expérimentales permettant d’estimer la formation d’espèces par la substance d’essai en phase aqueuse. Il faut instaurer une force ionique identique dans toutes les expériences en employant un électrolyte de fond.
13.
Les substances peu solubles dans l’eau ou présentant un POE élevé peuvent engendrer des problèmes dus au fait que leurs concentrations dans l’eau sont si faibles qu’il devient difficile de les déterminer avec exactitude. La présente méthode d’essai livre des indications sur la manière de traiter ce problème.
INFORMATIONS SUR LA SUBSTANCE D’ESSAI
14.
Le degré de pureté des réactifs chimiques doit au moins correspondre à celui de la qualité pour analyse. Il est recommandé d’utiliser des substances d’essai non marquées de composition chimique connue et d’une pureté d’au moins 99 % ou des substances d’essai radiomarquées de composition chimique et pureté radiochimique connues. S’il s’agit de traceurs à demi-vie courte, on appliquera des corrections pour tenir compte de la désintégration. Si la substance d’essai est radiomarquée, il y a lieu d’employer une méthode analytique spécifique à la substance de telle sorte que la radioactivité mesurée se rapporte directement à la substance d’essai.
15.
Il est possible d’estimer le log POE avec les logiciels vendus dans le commerce à cet effet, ou en s’appuyant sur le rapport des solubilités dans les deux solvants.
16.
Avant de déterminer le POE par la méthode du brassage lent, il faut disposer des informations suivantes sur la substance d’essai:
a)
formule structurale;
b)
méthodes analytiques appropriées à la détermination de la concentration de la substance dans l’eau et dans le 1-octanol;
c)
constante(s) de dissociation des substances ionisables [ligne directrice 112 de l’OCDE (9)];
d)
solubilité dans l’eau (10);
e)
hydrolyse abiotique (11);
f)
biodégradabilité immédiate (12);
g)
pression de vapeur (13).
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE
Matériel et appareillage
17.
Cette expérience nécessite du matériel courant de laboratoire, et en particulier:
—
des agitateurs magnétiques et des barres d’agitation magnétiques recouvertes de Teflon pour agiter la phase aqueuse,
—
des instruments d’analyse permettant de déterminer la concentration de la substance d’essai aux concentrations attendues,
—
une bouteille à agiter munie d’un robinet à sa base. Suivant l’estimation du log POE et le seuil de détection de la substance d’essai, on envisagera d’utiliser un réacteur d’un volume supérieur à un litre, de la même géométrie, de manière à obtenir un volume d’eau suffisant pour l’extraction et l’analyse chimiques de la substance d’essai. La concentration de la substance d’essai dans l’extrait aqueux sera donc plus élevée, ce qui rendra la détermination analytique plus fiable. Un tableau reproduisant des estimations du volume minimal requis, le seuil de détection de la substance, l’estimation de son log POE et de sa solubilité dans l’eau figure en appendice 1. Ce tableau se fonde sur la relation entre le log POE et le rapport des solubilités dans l’octanol et dans l’eau, telle que présentée par Pinsuwan et al. (14):
avec
(en molarité),
et sur la relation donnée par Lyman (15) pour prédire la solubilité dans l’eau. Les solubilités dans l’eau calculées avec l’équation donnée à l’appendice 1 sont à considérer comme une première estimation. Notons que l’utilisateur est libre d’estimer la solubilité dans l’eau à l’aide de n’importe quelle autre relation jugée mieux représenter la relation entre l’hydrophobie et la solubilité. S’agissant des substances solides, l’inclusion du point de fusion dans la prédiction de la solubilité est par exemple recommandée. Si l’on utilise une équation modifiée, il faut vérifier que l’équation permettant de calculer la solubilité dans l’octanol est toujours valable. Une bouteille à agiter recouverte d’une enveloppe de verre et d’une capacité d’environ un litre est schématisée en appendice 2. Les proportions de la bouteille représentée en appendice 2 se sont avérées propices et doivent être conservées si la dimension de l’appareil est modifiée,
—
il est essentiel de maintenir la température constante durant le brassage lent, à l’aide d’un dispositif adéquat.
18.
Les récipients doivent être composés d’un matériau inerte rendant négligeable l’adsorption à la surface des récipients.
Préparation des solutions expérimentales
19.
La détermination du POE requiert un 1-octanol de la qualité la plus pure qui puisse se trouver dans le commerce (au moins 99 %). Il est recommandé de purifier le 1-octanol par une extraction réalisée avec un acide, une base et de l’eau, suivie d’un séchage. Le 1-octanol peut, en plus, être purifié par distillation. Les solutions étalons des substances d’essai doivent être préparées avec du 1-octanol purifié. L’eau destinée à la détermination du POE doit être distillée à l’aide d’un dispositif en verre ou en quartz, ou traitée par un système de purification, ou encore être de qualité HPLC. Il convient de filtrer l’eau distillée à travers des mailles de 0,22 μm et d’inclure des blancs afin de s’assurer que les extraits concentrés ne renferment pas d’impuretés susceptibles d’interférer avec la substance d’essai. Si l’on emploie un filtre en fibres de verre, il faut le nettoyer en le laissant au moins trois heures dans un four à 400 °C.
20.
Afin de saturer chaque solvant par l’autre avant l’expérience, on les équilibre dans un récipient suffisamment grand. Pour ce faire, le système à deux phases est soumis à un brassage lent durant deux jours.
21.
Une concentration appropriée de la substance d’essai est choisie et dissoute dans du 1-octanol (saturé avec de l’eau). Il y a lieu de déterminer le coefficient de partage 1-octanol/eau dans des solutions diluées dans du 1-octanol et de l’eau. Aussi la concentration de la substance d’essai ne doit-elle pas excéder 70 % de sa solubilité avec une concentration maximale de 0,1 M dans chaque phase (1). Les solutions de 1-octanol utilisées pour l’expérience seront exemptes de substance d’essai en suspension à l’état solide.
22.
La quantité appropriée de substance d’essai est dissoute dans du 1-octanol (saturé avec de l’eau). Si l’estimation du log POE est supérieure à 5, il faut s’assurer que les solutions de 1-octanol utilisées pour l’expérience ne renferment pas de substance d’essai en suspension à l’état solide. À cette fin, la procédure suivante est appliquée pour les substances chimiques dont la valeur estimée de log POE > 5:
—
la substance d’essai est dissoute dans du 1-octanol (saturé avec de l’eau),
—
on laisse reposer la solution suffisamment longtemps pour que la substance suspendue à l’état solide se dépose. Durant la décantation, la concentration de la substance d’essai est mesurée en continu,
—
une fois que les concentrations mesurées dans la solution de 1-octanol ont atteint une valeur stable, la solution mère est diluée avec un volume approprié de 1-octanol,
—
la concentration de la solution mère diluée est mesurée. Si la concentration mesurée concorde avec la dilution, la solution mère diluée peut être utilisée dans le processus expérimental du brassage lent.
Extraction et analyse des échantillons
23.
Le dosage de la substance d’essai s’effectue par une méthode analytique validée. Les chercheurs doivent prouver que, durant l’essai, les concentrations dans le 1-octanol saturé avec de l’eau et dans la phase aqueuse saturée avec du 1-octanol sont supérieures au seuil de quantification du procédé analytique employé. Il y a lieu d’établir avant l’essai le taux de récupération par l’analyse de la substance d’essai en phase aqueuse et en phase 1-octanol, dans les cas où des méthodes d’extraction s’avèrent nécessaires. Le signal analytique doit être corrigé en fonction des blancs et l’on veillera à éviter tout transfert de la substance à analyser d’un échantillon à l’autre.
24.
Les concentrations des substances d’essai hydrophobes étant plutôt faibles en phase aqueuse, il faudra probablement extraire la substance de la phase aqueuse à l’aide d’un solvant organique et préconcentrer l’extrait avant analyse. Pour la même raison, il est nécessaire de réduire les éventuelles concentrations du blanc. À cette fin, on emploie des solvants très purs, de préférence des solvants pour l’analyse des résidus. En outre, un nettoyage soigneux (par exemple lavage au solvant ou cuisson à haute température) de la verrerie avant l’expérience peut diminuer le risque de contamination croisée.
25.
Il est possible d’estimer le log POE à l’aide d’un programme d’estimation ou en faisant appel à un expert. Si sa valeur est supérieure à six, d’une part il convient d’être très attentif aux corrections en fonction du blanc et à tout transfert de la substance à analyser d’un échantillon à l’autre et, d’autre part, il est impératif d’utiliser un étalon de substitution pour corriger le taux de récupération, de façon à pouvoir atteindre des facteurs de préconcentration élevés. Plusieurs logiciels d’estimation du log POE se trouvent dans le commerce (1), par exemple Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) et ACD logP (19). Les références (20-22) décrivent les différents procédés d’estimation.
26.
Les seuils de quantification pour la détermination de la substance d’essai dans le 1-octanol et dans l’eau sont établis suivant des méthodes acceptées. Comme principe de base, le seuil de quantification de la méthode employée peut être considéré comme étant la concentration dans l’eau ou le 1-octanol qui produit un rapport signal/bruit de dix. Il convient de choisir des méthodes d’extraction et de préconcentration appropriées et de spécifier le taux de récupération de l’analyse. Le facteur de préconcentration doit être choisi de façon à produire un signal de l’intensité requise lors de la détermination analytique.
27.
En fonction des paramètres de la méthode analytique et des concentrations escomptées, on détermine le volume de l’échantillon qui permettra de déterminer avec exactitude la concentration de la substance d’essai. L’utilisation d’échantillons aqueux trop petits pour obtenir un signal analytique suffisant est à éviter. Les échantillons aqueux ne doivent pas non plus être trop grands, car le volume d’eau restant risquerait d’être insuffisant pour le nombre minimal d’analyses requises (n = 5). L’appendice 1 indique les volumes minimaux des échantillons en fonction du volume du récipient, du seuil de détection de la substance d’essai et de sa solubilité.
28.
La quantification des substances d’essai s’effectue par comparaison avec les courbes d’étalonnage des substances d’essai. Les concentrations des étalons doivent figurer entre parenthèses à côté des concentrations relevées dans les échantillons analysées.
29.
Pour les substances d’essai dont le log POE estimé est supérieur à six, on verse un étalon de substitution dans l’échantillon aqueux avant l’extraction afin de relever les pertes survenues durant l’extraction et la préconcentration des échantillons aqueux. Pour que la correction du taux de récupération soit correcte, les étalons de substitution doivent avoir des propriétés très semblables ou identiques à celles de la substance d’essai. À cette fin, on utilise de préférence des analogues isotopiques (stables) marqués de la substance d’essai (perdeutériés ou marqués au 13C, par exemple). Si l’utilisation d’un isotope marqué stable, c’est-à-dire marqué au 13C ou au 2H, est impossible, il faut démontrer, en s’appuyant sur des données fiables tirées de publications, que les propriétés physico-chimiques de l’étalon de substitution sont très proches de celles de la substance d’essai. Des émulsions peuvent se former au cours de l’extraction liquide-liquide de la phase aqueuse. Pour réduire ce phénomène, on peut ajouter du sel et laisser reposer l’émulsion toute une nuit. Les méthodes utilisées pour extraire et préconcentrer les échantillons doivent être mentionnées.
30.
Les échantillons prélevés dans la phase 1-octanol peuvent, si nécessaire, être dilués avec un solvant adéquat avant l’analyse. De plus, l’utilisation d’étalons de substitution pour corriger la récupération est recommandée pour les substances qui se sont avérées présenter un degré de variation élevé lors des essais de récupération (écart-type relatif supérieur à 10 %).
31.
Les détails de la méthode analytique devront figurer dans le rapport. Ceux-ci incluent la méthode d’extraction, les facteurs de préconcentration et de dilution, les paramètres des instruments, le processus d’étalonnage, la gamme d’étalonnage, la récupération de la substance d’essai présente dans l’eau par un procédé analytique, l’ajout d’étalons de substitution pour corriger le taux de récupération, les valeurs des blancs, les seuils de détection et les seuils de quantification.
Déroulement de l’essai
Rapports volumiques 1-octanol/eau optimaux
32.
Les volumes d’eau et de 1-octanol sont choisis en fonction du seuil de quantification dans le 1-octanol et dans l’eau, des facteurs de préconcentration appliqués aux échantillons aqueux, des volumes prélevés dans le 1-octanol et dans l’eau et des concentrations prévues. Pour des raisons expérimentales, le volume de 1-octanol employé dans le système de brassage lent doit être choisi de telle sorte que la couche de 1-octanol soit suffisamment épaisse (> 0,5 cm) pour qu’un prélèvement puisse s’effectuer dans la phase 1-octanol sans la perturber.
33.
Les rapports volumiques utilisés couramment pour analyser des substances dont le log POE est supérieur ou égal à 4,5 sont de 20 à 50 ml de 1-octanol et de 950 à 980 ml d’eau dans un récipient d’un litre.
Conditions expérimentales
34.
Durant l’essai, le réacteur est thermostaté de manière à limiter la variation de température à moins de 1 °C. L’essai doit être conduit à 25 °C.
35.
On protège le système expérimental de la lumière du jour en effectuant l’essai dans une pièce obscure ou en recouvrant le réacteur d’une feuille d’aluminium.
36.
L’essai doit être mené dans un environnement aussi dépoussiéré que possible.
37.
Le système 1-octanol/eau est agité jusqu’à ce que l’équilibre soit atteint. Le temps requis pour atteindre l’équilibre est évalué au moyen d’un essai pilote de brassage lent au cours duquel on prélève de l’eau et de l’octanol périodiquement. Les temps de prélèvement doivent être espacés d’au moins cinq heures.
38.
Chaque détermination du POE doit s’effectuer sur la base d’au moins trois essais de brassage lent indépendants.
Détermination du temps requis pour parvenir à l’équilibre
39.
On admet que l’équilibre est atteint lorsque la régression du rapport des concentrations dans le 1-octanol et dans l’eau en fonction du temps (la variable temps comprenant quatre point s) se traduit par une pente ne s’écartant pas de manière significative de zéro pour une valeur de p égale à 0,05. Le temps minimal requis pour atteindre l’équilibre avant de pouvoir commencer les prélèvements est d’un jour. En principe, le prélèvement des substances dont le log POE estimé est inférieur à cinq peut s’effectuer au cours des deuxième et troisième jours. Il est possible que le temps pour parvenir à l’équilibre soit plus long pour les substances plus hydrophobes. Pour une substance ayant un log POE égal à 8,23 (décachlorobiphényle), 144 heures ont été suffisantes pour atteindre l’équilibre. L’équilibre est évalué par une série de prélèvements effectués dans le même récipient.
Début de l’essai
40.
On commence par remplir le réacteur avec de l’eau saturée en 1-octanol. Ensuite, on attend que le système atteigne la température requise par le thermostat.
41.
La quantité voulue de substance d’essai (dissoute dans le volume requis de 1-octanol saturé en eau) est ajoutée soigneusement au réacteur. Il s’agit d’une étape critique de l’essai car il faut éviter le mélange turbulent des deux phases. À cette fin, la phase 1-octanol peut être versée doucement à l’aide d’une pipette sur la paroi du récipient d’essai, à proximité de la surface de l’eau. Elle ruissellera ainsi le long de la paroi et formera un film au dessus de la phase aqueuse. Il faut toujours éviter de décanter le 1-octanol directement dans la bouteille; on ne peut pas faire tomber des gouttes de 1-octanol directement dans l’eau.
42.
Une fois l’agitation lancée, on augmente lentement sa vitesse. Si les moteurs de l’agitateur ne peuvent être réglés correctement, on envisagera d’utiliser un transformateur. La vitesse d’agitation doit être réglée de manière à créer un vortex à l’interface entre l’eau et le 1-octanol d’une profondeur de 0,5 à 2,5 cm au maximum. Il faut diminuer la vitesse d’agitation si la profondeur du vortex dépasse 2,5 cm, sinon des micro-gouttelettes de 1-octanol peuvent se former dans la phase aqueuse et donner lieu à une surestimation de la concentration de la substance d’essai dans l’eau. D’après les résultats d’un essai tournant de validation (5), on recommande d’appliquer une vitesse maximale d’agitation de 2,5 cm. Elle représente un compromis permettant de parvenir rapidement à l’équilibre tout en limitant la formation de microgouttelettes de 1-octanol.
Prélèvement et traitement des échantillons
43.
Il convient d’arrêter l’agitateur avant d’effectuer les prélèvements et d’attendre que les liquides s’immobilisent. Lorsque le prélèvement est terminé, l’agitateur est remis en marche doucement, comme décrit plus haut; après quoi on augmente la vitesse d’agitation progressivement.
44.
La phase aqueuse est prélevée à un robinet situé à la base du réacteur. Il faut toujours éliminer le volume mort d’eau contenu dans les robinets (environ 5 ml pour le récipient illustré à l’appendice 2). L’eau retenue dans les robinets n’est pas agitée et donc pas en équilibre avec l’ensemble. On note le volume des échantillons aqueux et on vérifie que la quantité de substance d’essai présente dans l’eau éliminée est prise en compte dans l’établissement du bilan massique. Il y a lieu de réduire au minimum les pertes par évaporation en permettant à l’eau de s’écouler doucement dans l’entonnoir séparateur de façon à ne pas perturber la couche eau/1-octanol.
45.
On prélève les échantillons de 1-octanol en aspirant une petite aliquote (environ 100 μl) de la couche 1-octanol au moyen d’une seringue de 100 microlitres en verre et métal. Il faut veiller à ne pas perturber l’interface. Le volume de liquide prélevé est consigné. Une petite aliquote suffit, étant donné que l’échantillon de 1-octanol sera dilué.
46.
Les étapes inutiles de transfert d’échantillons sont à éviter. Aussi le volume des échantillons est-il déterminé par gravimétrie. Dans le cas des échantillons aqueux, cette détermination s’effectue par la collecte de l’échantillon aqueux dans un entonnoir séparateur contenant déjà le volume de solvant requis.
RÉSULTATS ET RAPPORT
47.
La méthode d’essai prescrit de déterminer le POE en conduisant trois essais à brassage lent (trois unités expérimentales) dans des conditions expérimentales identiques. La régression utilisée pour démontrer que l’équilibre a été atteint doit s’appuyer sur les résultats d’au moins quatre déterminations du rapport CO/CE effectuées à quatre moments ponctuels successifs. La variance ainsi calculée correspond à une mesure de l’incertitude de la valeur moyenne obtenue pour chaque unité expérimentale.
48.
Le POE peut être caractérisé par la variance des données recueillies pour chaque unité expérimentale. Cette information est employée pour calculer le POE en considérant qu’il équivaut à la moyenne pondérée des résultats de chaque unité expérimentale. Pour ce faire, l’inverse de la variance des résultats des unités expérimentales est employé comme coefficient pondérateur. Ainsi, les données accusant une forte variation (exprimée par la variance), qui sont donc moins fiables, ont moins d’influence sur le résultat que les données offrant une variance faible.
49.
L’écart-type pondéré est calculé d’une manière analogue. Il caractérise la répétabilité de la mesure du POE. Un écart-type pondéré faible traduit une répétabilité élevée de la détermination du POE au sein d’un même laboratoire. Le traitement statistique formel des données est résumé ci-dessous.
Traitement des résultats
Démonstration de la réalisation de l’équilibre
50.
Le logarithme du rapport des concentrations de la substance d’essai dans le 1-octanol et dans l’eau (log CO/CE) est calculé pour chaque instant de prélèvement. On démontre que l’équilibre chimique est atteint en traçant une courbe de ce rapport en fonction du temps. L’apparition d’un plateau sur ce tracé, établi à partir d’au moins quatre points consécutifs sur l’axe du temps, indique que l’équilibre a été atteint et que le composé est complètement dissous dans le 1-octanol. Dans le cas contraire, il faut poursuivre l’essai jusqu’à ce que quatre points de temps successifs présentent une pente qui n’est pas significativement différente de zéro, pour une valeur de p = 0,05, montrant ainsi que le log CO/CE est indépendant du temps.
Calcul du log POE
51.
La valeur du log POE de l’unité expérimentale correspond à la moyenne pondérée du log CO/CE pour la partie de la courbe du log CO/CE en fonction du temps, pour laquelle l’état d’équilibre a été démontré. On calcule la moyenne pondérée en pondérant les données avec l’inverse de la variance de telle sorte que l’influence des données sur le résultat final est inversement proportionnelle à l’incertitude des données.
Moyenne des log POE
52.
La valeur moyenne du log POE de différentes unités expérimentales correspond à la moyenne des résultats de chaque unité expérimentale pondérés avec leurs variances respectives.
Le calcul répond à la formule suivante:
où:
log POE,i
=
est la valeur du log POE de chaque unité expérimentale i;
log POE moy
=
est la moyenne pondérée de tous les log POE;
wi
=
est le poids statistique attribué à la valeur log POE de l’unité expérimentale i.
L’inverse de la variance de log POE,i est représentée par wi ().
53.
L’estimation de l’erreur de la moyenne de log POE correspond à la répétabilité des log CO/CE déterminés durant la phase d’équilibre dans chaque unité expérimentale. Elle se traduit par l’écart-type pondéré du log POE moy (σlog Poe moy) qui mesure l’erreur associée au log POE moy. L’écart-type pondéré peut être calculé à partir de la variance pondérée (varlog Poe moy) de la façon suivante:
où n représente le nombre d’unités expérimentales.
Rapport d’essai
54.
Le rapport d’essai doit mentionner les informations suivantes:
Substance d’essai:
—
nom courant, nom chimique, numéro CAS, formule structurale (montrant la position du radiomarqueur, le cas échéant) et propriétés physico-chimiques pertinentes (voir paragraphe 17),
—
pureté (impuretés) de la substance d’essai,
—
pureté radiochimique des substances marquées et activité molaire (s’il y a lieu),
—
estimation préliminaire du log POE et méthode utilisée pour ce calcul.
Conditions expérimentales:
—
dates de la réalisation des études,
—
température à laquelle s’est déroulé l’essai,
—
volumes de 1-octanol et d’eau au début de l’essai,
—
volumes des échantillons de 1-octanol et d’eau prélevés,
—
volumes de 1-octanol et d’eau restant dans les récipients expérimentaux;
—
description des récipients expérimentaux et des conditions d’agitation utilisées (géométrie de la barre d’agitation et du récipient expérimental, hauteur du vortex en mm et vitesse d’agitation si elle est connue),
—
méthodes analytiques utilisées pour déterminer la substance d’essai et seuil de quantification de la méthode,
—
heures de prélèvement,
—
pH de la phase aqueuse et tampons utilisés, lorsqu’on a ajusté le pH pour des molécules ionisables,
—
nombre d’expériences identiques.
Résultats:
—
répétabilité et sensibilité des méthodes analytiques employées,
—
concentrations de la substance d’essai déterminées dans le 1-octanol et dans l’eau en fonction du temps,
—
démonstration du bilan massique,
—
température et écart-type ou gamme de températures appliquée durant l’essai,
—
régression du rapport des concentrations en fonction du temps,
—
valeur moyenne de POE moy et son écart-type,
—
analyse et interprétation des résultats,
—
exemples de données brutes d’une analyse représentative (toutes les données brutes doivent être conservées conformément aux bonnes pratiques de laboratoire), notamment le taux de récupération des produits de substitution, le nombre de niveaux appliqué à l’étalonnage (ainsi que les critères régissant le coefficient de corrélation de la courbe d’étalonnage) et résultats de l’assurance qualité/contrôle qualité (AQ/CQ),
—
s’il est disponible: rapport de validation du protocole expérimental (à mentionner parmi les références).
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(2)
Chapitre A.8 de la présente annexe, Coefficient de partition.
(3)
Chapter A.8 de la présente annexe, Coefficient de partition.
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(10)
Chapitre A.6 de la présente annexe, Solubilité dans l’eau.
(11)
Chapitre C.7 de la présente annexe, Dégradation – Dégradation abiotique: hydrolyse en fonction du pH.
(12)
Chapitre C.4 – Parties II à VII (Méthode A à F) de la présente annexe, Détermination de la biodégradabilité immédiate.
(13)
Chapitre A.4 de la présente annexe, Pression de vapeur.
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(22)
Jübermann O. (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386-390.
Appendice 1
Tables permettant de calculer les volumes d’eau minimaux requis pour détecter des substances d’essai ayant différentes valeurs de log POE en phase aqueuse
Hypothèses:
—
Volume maximal de chaque aliquote = 10 % du volume total; 5 aliquotes = 50 % du volume total.
—
. Si les concentrations sont inférieures, il faudra utiliser de plus grands volumes.
—
Volume utilisé pour la détermination du seuil de détection = 100 ml.
—
Log POE en fonction du log SE et le log POE en fonction de SR (Soct/Se) sont des représentations raisonnables de relations pour les substances d’essai.
