Règlement (UE) n ° 900/2014 de la Commission du 15 juillet 2014 modifiant, aux fins de son adaptation au progrès technique, le règlement (CE) n ° 440/2008 établissant des méthodes d'essai conformément au règlement (CE) n ° 1907/2006 du Parlement européen et du Conseil concernant l'enregistrement, l'évaluation et l'autorisation des substances chimiques, ainsi que les restrictions applicables à ces substances (REACH) Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE

«B.53. ÉTUDE DE NEUROTOXICITE POUR LE DEVELOPPEMENT

INTRODUCTION

1. La présente méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice pour les essais de produits chimiques no 426 (2007) de l'OCDE. En juin 1995, à Copenhague, un groupe de travail de l'OCDE sur la toxicité pour la reproduction et le développement a débattu de la pertinence d'une actualisation des lignes directrices de l'OCDE existantes sur la toxicité pour la reproduction et le développement, et de l'élaboration de nouvelles lignes directrices sur des effets qui ne sont pas actuellement couverts (1). Le groupe de travail a recommandé la rédaction d'une ligne directrice concernant la neurotoxicité pour le développement, fondée sur une ligne directrice de l'Agence des États-Unis pour la protection de l'environnement (US EPA), révisée depuis (2). Une seconde réunion de consultation s'est tenue en juin 1996 à Copenhague avec pour objet de livrer au secrétariat des informations sur l'avant-projet d'une nouvelle ligne directrice sur la neurotoxicité pour le développement, notamment concernant des éléments majeurs tels que des précisions sur le choix de l'espèce animale, la période d'administration, la durée de l'essai, les effets à évaluer et les critères d'évaluation des résultats. L'US EPA a publié une ligne directrice sur l'évaluation des risques neurotoxiques en 1998 (3). Une consultation d'experts de l'OCDE et un atelier de travail de l'Institut des sciences du risque ISLI se sont tenus parallèlement en octobre 2000, tandis qu'une consultation d'experts a eu lieu à Tokyo en 2005. Ces rencontres avaient dans leur ensemble pour objectif de débattre de questions scientifiques et techniques relatives à l'actuelle ligne directrice, et les recommandations qui en ont résulté (4) (5) (6) (7) ont été prises en compte lors de l'élaboration de la présente méthode d'essai. Les documents d'orientation no 43 “Reproductive Toxicity Testing and Assessment” (8) et no 20 “Neurotoxicity testing” (9) contiennent d'autres informations sur la mise en œuvre, l'interprétation et la terminologie relatives à cette méthode d'essai.

REMARQUES PRÉLIMINAIRES

2. De nombreuses substances chimiques sont connues pour entraîner des effets neurotoxiques sur le développement chez l'homme et chez d'autres espèces (10) (11) (12) (13). Il est parfois nécessaire de déterminer la neurotoxicité potentielle pour le développement d'une substance chimique et d'estimer et d'évaluer ses caractéristiques toxiques. Les études de neurotoxicité pour le développement ont pour objectif de produire des résultats relatifs aux effets fonctionnels et morphologiques potentiels exercés sur le système nerveux en développement de la progéniture après exposition in utero et aux premiers stades de la vie, notamment des caractérisations par des courbes de réponse à la dose.

3. Une étude de neurotoxicité pour le développement peut être menée isolément, ou intégrée dans une étude de toxicité pour la reproduction et/ou de neurotoxicité chez l'adulte [par exemple méthodes d'essai B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16)], ou encore annexée à une étude de toxicité pour le développement prénatal [par exemple méthode d'essai B.31 (17)]. Si l'étude est intégrée dans une autre étude ou annexée, il est impératif de maintenir l'intégrité des deux types d'études. Tous les essais doivent être conformes à la législation en vigueur et aux lignes directrices gouvernementales et institutionnelles applicables concernant l'utilisation des animaux de laboratoire à des fins de recherche (par exemple 18).

4. Le laboratoire qui mène l'essai doit tenir compte de toutes les informations disponibles sur la substance d'essai avant de procéder à l'étude. Il s'agit notamment d'informations sur l'identité et la structure de la substance chimique, sur ses propriétés physico-chimiques, sur les résultats de tout autre essai de toxicité in vitro ou in vivo réalisé sur la substance, sur les données toxicologiques relatives à d'autres substances chimiques apparentées, ainsi que sur la ou les utilisations prévues de la substance. Ces renseignements sont nécessaires pour convaincre toutes les parties intéressées de l'intérêt de l'essai pour la protection de la santé humaine, et ils seront utiles pour déterminer la dose initiale appropriée.

PRINCIPE DE L'ESSAI

5. La substance d'essai est administrée aux animaux pendant les périodes de gestation et de lactation. Les mères sont testées pour évaluer les effets sur les femelles gravides et allaitantes, avec pour objectif additionnel l'acquisition d'informations comparatives (entre mère et progéniture). La neurotoxicité est évaluée sur des descendants sélectionnés au hasard dans les portées. L'évaluation comprend des observations destinées à détecter des anomalies neurologiques macroscopiques et comportementales, notamment l'examen du développement physique, de l'ontogénie comportementale, de l'activité motrice, des fonctions motrices et sensorielles, et de l'apprentissage et de la mémoire, ainsi que l'évaluation pondérale du cerveau et de la neuropathologie au cours du développement postnatal et à l'âge adulte.

6. Lorsque la méthode d'essai est mise en œuvre dans le cadre d'une étude séparée, il est possible d'appliquer sur des animaux surnuméraires disponibles dans chaque groupe des protocoles spécifiques d'étude du neurocomportement, de neuropathologie, de neurochimie ou d'électrophysiologie susceptibles de compléter les résultats obtenus par les examens recommandés par la présente méthode d'essai (16) (19) (20) (21). Ces protocoles présentent un intérêt particulier lorsque l'observation empirique, les effets escomptés ou le mécanisme ou le mode d'action évoquent un type spécifique de neurotoxicité. Ces protocoles supplémentaires peuvent être appliqués aux mères aussi bien qu'aux petits. Il est également possible de recourir à d'autres protocoles ex vivo ou in vitro, sous réserve qu'ils n'altèrent pas l'intégrité des protocoles in vivo.

PRÉPARATIONS EN VUE DE L'ESSAI

Sélection de l'espèce animale

7. L'espèce animale expérimentale privilégiée est le rat; d'autres espèces peuvent être utilisées, s'il y a lieu. Toutefois, il convient de noter que le nombre de jours de gestation et de développement postnatal spécifiés dans cette méthode d'essai correspond à des souches de rats couramment utilisées, et que des durées comparables devront être choisies dans le cas de l'utilisation d'une autre espèce ou d'une souche inhabituelle. L'emploi d'une autre espèce sera justifié par des données toxicologiques, pharmacocinétiques, et/ou d'une autre nature. La légitimation du choix doit s'appuyer sur des évaluations neurocomportementales et neuropathologiques postnatales déjà disponibles, spécifiques de l'espèce. Lorsqu'un essai antérieur a produit des résultats préoccupants, il convient de se pencher sur l'espèce ou la souche utilisée pour cet essai. Les différentes souches de rat se caractérisent par des performances dissemblables et il convient donc de fournir les preuves démontrant que la souche sélectionnée présente une fécondité et une réactivité adéquates. La fiabilité et la sensibilité de la détection de la neurotoxicité pour le développement sur les autres espèces devront être documentées.

Conditions d'hébergement et d'alimentation

8. La température du local abritant les animaux expérimentaux doit être de 22 ± 3 °C. L'humidité relative doit atteindre au moins 30 % et, de préférence, elle n'excédera pas 70 %, sauf pendant le nettoyage du local, mais il faut s'efforcer de la maintenir à 50-60 %. L'éclairage doit être artificiel, avec une alternance de 12 heures de lumière et de 12 heures d'obscurité. Il est possible d'inverser le cycle d'éclairage avant l'accouplement et pendant la durée de l'étude, afin de procéder aux évaluations des effets fonctionnels et comportementaux pendant la période d'obscurité (sous lumière rouge), c'est-à-dire pendant la période d'activité normale des animaux (22). Toute modification du cycle lumière-obscurité doit inclure une période d'acclimatation suffisante pour l'adaptation des animaux aux nouvelles conditions. L'alimentation correspond à des régimes de laboratoire conventionnels avec accès illimité à l'eau de boisson. Il y a lieu de consigner la nature des aliments et de l'eau et d'analyser ceux-ci pour détecter la présence de contaminants.

9. Les animaux peuvent être logés individuellement ou réunis dans des cages en petits groupes du même sexe. L'accouplement doit avoir lieu dans des cages adaptées à cet usage. Dès confirmation de la copulation ou avant le 15e jour de gestation, les animaux fécondés doivent être placés individuellement dans des cages de mise bas ou de maternité. Cet équipement doit être aménagé pour réduire au minimum les éventuels effets de placement en cage. Les femelles fécondées disposeront de matériaux de nidification adéquats et bien définis aux abords de la mise bas. Il est notoire qu'une manipulation ou un stress superflu pendant la gestation peut provoquer des effets indésirables, notamment un avortement ou un développement fœtal ou postnatal perturbé. Afin de se prémunir contre une mortalité fœtale due à des facteurs non liés au traitement, il convient de manipuler avec soin les animaux pendant la gestation, et d'éviter tout stress exercé par des facteurs externes tels qu'un bruit excessif.

Préparation des animaux

10. Il faut utiliser des animaux sains, acclimatés aux conditions de laboratoire et n'ayant préalablement subi aucun traitement expérimental, à moins que l'étude ne soit incorporée dans une autre étude (voir paragraphe 3). Les animaux expérimentaux doivent être caractérisés en termes d'espèce, de souche, de source, de sexe, de poids et d'âge. Chaque animal doit être affecté et marqué d'un numéro d'identification individuel. Il convient de maintenir autant que possible une uniformité de poids et d'âge des animaux, dans tous les groupes de l'essai, et de se trouver dans la gamme de valeurs normales de l'espèce et de la souche étudiées. À chaque niveau de dose, il faut utiliser des animaux femelles nullipares adultes jeunes. Les individus d'une même fratrie ne peuvent pas être accouplés, et des précautions doivent être prises dans ce sens. Le jour de gestation (JG) 0 est le jour auquel on observe un bouchon vaginal et/ou des spermatozoïdes. Les animaux à gestation datée acquis auprès d'un fournisseur disposeront d'une période d'acclimatation adéquate (par exemple 2-3 jours). Les femelles fécondées doivent être affectées sans biais aux groupes témoin et de traitement et, dès que possible, uniformément réparties dans les groupes (par exemple il est recommandé d'employer un protocole aléatoire stratifié pour uniformiser la répartition entre tous les groupes, notamment fondé sur le poids corporel). Les femelles inséminées par le même mâle doivent être également réparties dans les groupes.

PROTOCOLE

Nombre et sexe des animaux

11. Chaque groupe traité et témoin doit contenir un nombre suffisant de femelles gravides exposées à la substance d'essai afin de garantir l'obtention d'un nombre adéquat de descendants pour évaluer la neurotoxicité. Un nombre total de 20 portées est recommandé pour chaque niveau de dose. Il est possible d'utiliser des modèles d'administration avec répétition des expériences et groupes échelonnés sous réserve que le nombre total de portées par groupe soit adéquat, et que des modèles statistiques appropriés soient utilisés pour tenir compte des expériences identiques.

12. Au jour 4 après la naissance (JAN 4) ou avant (le jour de la mise bas est JAN 0), la taille de chaque portée doit être ajustée en éliminant les petits en excès par sélection aléatoire pour que toutes les portées soient de taille identique (23). La taille de la portée ne doit pas dépasser la taille de portée moyenne pour la souche de rongeur utilisée (8-12). Les nombres de petits mâles et femelles doivent être aussi proches que possible de l'égalité. Il ne convient pas de procéder à une élimination sélective des petits basée, par exemple, sur le poids corporel. Après standardisation des portées (restriction) et avant toute analyse des effets fonctionnels, chaque petit sur lequel on a programmé des essais présevrage ou postsevrage doit être identifié individuellement par une méthode humaine adéquate d'identification des petits (par exemple 24).

Affectation des animaux aux essais fonctionnels et comportementaux, aux mesures de poids du cerveau et aux évaluations neuropathologiques

13. La méthode d'essai admet des approches diverses quant à la répartition des animaux exposés in utero et via l'allaitement dans les différents essais fonctionnels et comportementaux, à la détermination de la maturité sexuelle et du poids du cerveau et à l'évaluation neuropathologique (25). Il est possible d'ajouter d'autres essais sur la fonction neurocomportementale (par exemple comportement social), ou des essais de neurochimie ou de neuropathologie, au cas par cas, à condition que l'intégrité des essais initiaux requis ne soit pas compromise.

14. Les petits sont sélectionnés dans chaque groupe de dose et affectés à une évaluation d'effet au JAN 4 ou après. La sélection des petits doit permettre, dans la mesure du possible, une représentation équilibrée des deux sexes de chaque portée, pour chaque groupe de dose, dans tous les essais. Dans le test d'activité motrice, il convient d'analyser la même paire de petits mâle et femelle à tous les âges de présevrage (voir paragraphe 35). Pour tous les autres essais, on peut affecter des paires identiques ou différentes d'animaux mâles et femelles aux différents essais comportementaux. Pour l'étude de la fonction cognitive, il peut s'avérer nécessaire d'affecter des petits différents aux essais sur animaux immatures et sur animaux adultes, afin d'éviter toute confusion entre les effets de l'âge et les effets d'un entraînement antérieur pour ces mesures (26) (27). Au moment du sevrage (JAN 21), les petits qui ne sont pas sélectionnés pour des tests peuvent être sacrifiés humainement. Toute modification de la répartition des petits doit être consignée. L'unité statistique de la mesure est la portée (ou la mère) et non le petit.

15. Il existe différentes façons de répartir les petits dans les examens présevrage et postsevrage, les essais cognitifs, les examens pathologiques, etc. (un modèle général est proposé à la figure 1 et des exemples de répartition sont présentés dans l'appendice 1). Il est recommandé d'employer les nombres minimaux suivants d'animaux dans chaque groupe de dose pour les examens présevrage et postsevrage:

Dosage

16. On doit utiliser au moins trois niveaux de doses différents et un groupe témoin en parallèle. Les niveaux de dose doivent être espacés de façon à produire une gradation des effets toxiques. Si elle n'est pas limitée par les propriétés physico-chimiques ou biologiques de la substance d'essai, la dose la plus élevée doit être choisie en vue d'induire une certaine toxicité pour la mère [par exemple signes cliniques, diminution du gain de poids corporel (pas plus de 10 %) et/ou preuve de toxicité limitée par la dose dans un organe cible]. La dose élevée ne doit pas dépasser 1 000 mg/kg/jour de poids corporel, sauf exception, par exemple, si l'exposition humaine prévue indique qu'il est nécessaire d'utiliser une dose plus élevée. Il est également possible de mener des études pilotes ou des études préliminaires de détermination d'un ordre de grandeur afin de définir la dose la plus élevée qu'il faut utiliser pour produire une toxicité minimale pour la mère. Lorsque la substance d'essai s'est révélée toxique sur le plan du développement dans une étude standard de toxicité pour le développement ou dans une étude pilote, la dose la plus élevée doit être la dose maximale qui n'induit pas de toxicité excessive pour la descendance, ni de mort in utero ou néonatale, ni de malformations, qui empêcherait une évaluation significative de la neurotoxicité. La dose la plus faible ne doit produire aucun signe de toxicité pour la mère ni de toxicité pour le développement, notamment de neurotoxicité. Il convient de sélectionner une séquence de doses décroissantes en vue de mettre en évidence une relation dose-effet et une concentration sans effet nocif observé (CSENO), ou des doses proches de la limite de détection permettant de déterminer un niveau de référence. Les intervalles optimaux au sein d'une séquence de doses décroissantes sont souvent d'un facteur de 2 à 4 et l'adjonction d'un quatrième groupe de dose est souvent préférable à l'administration de doses très espacées (par exemple par un facteur de plus de 10).

17. Il convient de choisir des niveaux de dose en considérant toutes les données existantes sur la toxicité ainsi que d'autres informations sur le métabolisme et la toxicocinétique de la substance d'essai ou de composés apparentés. Ces informations contribueront également à justifier l'échelle des doses. Il faut envisager l'administration directe aux petits en se fondant sur des informations relatives à l'exposition et à la pharmacocinétique (28) (29). Il faudra soigneusement évaluer les avantages et les inconvénients avant la mise en œuvre d'études d'administration directe (30).

18. Le groupe témoin étudié en parallèle doit être un groupe témoin fictivement traité ou un groupe témoin traité par le véhicule, lorsqu'un véhicule est utilisé pour administrer la substance d'essai. Tous les groupes doivent recevoir le même volume de substance d'essai ou de véhicule, rapporté au poids corporel. Lorsqu'un véhicule ou un autre adjuvant est utilisé pour faciliter l'administration, il convient de tenir compte des caractéristiques suivantes: effets sur l'absorption, la distribution, le métabolisme, ou la rétention de la substance d'essai; effets sur les propriétés chimiques de la substance d'essai susceptibles de modifier ses caractéristiques toxiques; effets sur la consommation d'aliments ou d'eau ou l'état nutritionnel des animaux. Le véhicule ne doit provoquer aucun effet susceptible d'interférer avec l'interprétation de l'étude et ne doit induire aucune toxicité sur le plan neurocomportemental, ni exercer d'effets sur la reproduction ou le développement. Dans le cas de l'utilisation de nouveaux véhicules, il convient d'inclure dans l'étude, outre le groupe véhicule témoin, un groupe témoin fictivement traité. Les animaux inclus dans le ou les groupes témoins doivent être manipulés exactement comme les animaux des groupes d'essai.

Administration des doses

19. La substance d'essai ou le véhicule doivent être administrés par la voie la plus représentative de l'exposition humaine potentielle, en fondant le choix sur des informations disponibles sur le métabolisme et la distribution dans les animaux expérimentaux. La voie d'administration sera généralement orale (par exemple gavage, aliments ou eau de boisson), mais il est possible d'utiliser d'autres voies (par exemple voie cutanée, inhalation), justifiées par des caractéristiques particulières ou des voies d'exposition de l'homme envisagées ou connues [d'autres informations sont fournies dans le document d'orientation no 43 (8)]. Il convient de motiver le choix de la voie d'administration. La substance d'essai doit être administrée tous les jours à peu près au même moment.

20. La dose administrée à chaque animal dépend normalement de la mesure la plus récente du poids corporel du sujet. Toutefois, les doses devront être ajustées avec précaution dans le dernier tiers de la gestation. Si une toxicité excessive est observée sur les mères traitées, elles seront humainement sacrifiées.

21. La substance d'essai ou le véhicule doivent être administrés au minimum quotidiennement aux femelles fécondées à partir du moment de l'implantation (JG 6) et jusqu'à la fin de la lactation (JAN 21), de façon à exposer les petits à la substance d'essai pendant le développement neurologique prénatal et postnatal. L'âge au début de l'administration et la durée et la fréquence des administrations peuvent être ajustés, s'il est démontré qu'un autre modèle expérimental correspond mieux aux expositions de l'homme. Les durées d'administration doivent être adaptées aux autres espèces de façon à garantir une exposition pendant toutes les périodes précoces du développement du cerveau (c'est-à-dire équivalentes à la croissance cérébrale humaine prénatale et postnatale précoce). Il est possible de commencer l'administration au début de la gestation (JG 0), mais il convient d'envisager que la substance d'essai puisse entraîner une perte préimplantatoire. Le choix d'une administration à partir du JG 6 permettrait d'écarter ce risque, mais les stades du développement compris entre JG 0 et 6 ne seraient alors pas traités. Il est impossible de commencer l'administration à JG 0 sur des animaux à accouplement daté acquis par le laboratoire, et JG 6 semble par conséquent un bon compromis de jour de départ. Le laboratoire d'essai prendra soin d'ajuster le régime posologique conformément aux informations pertinentes dont il dispose sur les effets de la substance d'essai, avant l'expérience, et conformément à des considérations logistiques, notamment par le prolongement de l'administration après le sevrage. Il est préférable d'interrompre l'administration le jour de la parturition chez les animaux qui n'ont pas mis bas tous leurs descendants. On estime en général que les petits sont exposés par l'intermédiaire du lait maternel; toutefois, l'administration directe aux petits doit être envisagée dans les cas d'absence de preuve d'une exposition continue de la progéniture. Ces preuves peuvent être tirées, par exemple, d'informations pharmacocinétiques, de toxicité sur la progéniture ou de modification des marqueurs biologiques (28).

OBSERVATIONS

Observations sur les mères

22. Toutes les mères doivent faire l'objet d'une observation attentive au moins une fois par jour, afin de constater leur état de santé et de relever la morbidité et la mortalité.

23. Pendant les périodes de traitement et d'observation, des examens cliniques plus détaillés sont périodiquement menés (au moins deux fois pendant la période d'administration au cours de la gestation et deux fois pendant la période d'administration au cours de la lactation), en employant au moins dix mères par dose. Les animaux doivent être observés à l'extérieur de leur cage d'habitation, par des techniciens formés ignorant le traitement des animaux, et suivant des protocoles normalisés visant à limiter autant que possible les biais liés au stress des animaux, à l'observateur, et à optimiser la reproductibilité interobservateurs. Dans la mesure du possible, il est préférable que toutes les observations d'une étude donnée soient réalisées par le même technicien.

24. La présence de signes observés doit être consignée. Autant que possible, leur ampleur doit également être notée. Les observations cliniques incluront, sans s'y limiter, des modifications de l'état de la peau, de la fourrure, des yeux, des muqueuses, la présence de sécrétions, et l'activité autonome (par exemple larmoiement, horripilation, taille des pupilles, mode de respiration inhabituel, et/ou respiration par la bouche, et tous signes inhabituels de miction ou défécation).

25. Il faut également noter toutes les réactions inhabituelles dans la position du corps, le niveau d'activité (par exemple augmentation ou diminution de l'exploration de la zone standard) et la coordination des mouvements. Les modifications de la marche (par exemple marche en canard, ataxie), de la posture (par exemple dos rond) et de la réactivité à la manipulation, à la pose ou à d'autres stimuli environnementaux, ainsi que la présence de mouvements cloniques ou toniques, de convulsions, de tremblements, de stéréotypies (par exemple toilettage excessif, mouvements inhabituels de la tête, déplacements répétés en cercle), de comportements étranges (par exemple morsures ou léchage excessif, automutilation, marche à reculons, vocalisation), ou d'agression doivent être enregistrés.

26. Les signes de toxicité doivent être enregistrés, notamment le jour de leur apparition, le moment de la journée, leur degré et leur durée.

27. Les animaux sont pesés au moment de l'administration au moins une fois par semaine pendant toute l'étude, ou le jour de la mise bas ou à un moment proche de ce jour et à JAN 21 (sevrage). Dans les études par gavage, les mères doivent être pesées au moins deux fois par semaine. Les doses sont ajustées au moment de chaque pesée, s'il y a lieu. La consommation d'aliments est mesurée une fois par semaine au moins pendant la gestation et la lactation. La consommation d'eau doit être mesurée au moins une fois par semaine si les animaux sont exposés par l'eau de boisson.

Observations sur la progéniture

28. Tous les petits doivent être attentivement examinés au moins quotidiennement pour détecter les signes de toxicité et déterminer la morbidité et la mortalité.

29. Pendant les périodes de traitement et d'observation, des examens cliniques plus détaillés des descendants doivent être réalisés. La progéniture (au moins un petit/sexe/portée) doit être observée par des techniciens formés ignorant le traitement des animaux, suivant des protocoles normalisés visant à réduire au minimum les biais et à optimiser la reproductibilité interobservateurs. Dans la mesure du possible, il est préférable que les observations soient réalisées par le même technicien. On contrôlera au minimum les effets décrits dans les paragraphes 24 et 25, s'ils s'appliquent au stade du développement étudié.

30. Tous les signes de toxicité sur la progéniture doivent être consignés, notamment le jour de leur apparition, le moment de la journée, leur degré et leur durée.

Marqueurs physiques et développementaux

31. Les modifications des marqueurs du développement antérieurs au sevrage (par exemple dépliement du pavillon de l'oreille, ouverture des yeux, poussée des incisives) sont étroitement corrélées au poids corporel (30) (31). Le poids corporel est donc souvent le meilleur indicateur du développement physique. Il est par conséquent recommandé de mesurer les marqueurs de développement uniquement lorsque les indices préalables suggèrent que ces données fourniront de nouvelles informations. Le calendrier d'évaluation de ces paramètres est indiqué dans le tableau 1. En se fondant sur les effets anticipés et les résultats des mesures initiales, il peut être judicieux d'ajouter d'autres dates d'examen ou de réaliser les mesures à d'autres stades du développement.

32. Il est préférable d'utiliser l'âge postcoïtal plutôt que l'âge postnatal pour évaluer le développement physique (33). Si l'essai est réalisé le jour du sevrage, il est recommandé d'examiner les petits avant sevrage effectif pour éviter toute confusion avec l'effet du stress associé au sevrage. De surcroît, on ne procédera à aucun examen postsevrage des petits au cours des deux jours qui suivent cet événement.

Tableau 1

Calendrier d'évaluation des marqueurs physiques et développementaux, et des effets fonctionnels/comportementaux (2)

33. Les petits vivants doivent être comptés et sexés, par exemple, par examen visuel ou mesure de la distance ano-génitale (34) (35), et chaque petit d'une portée doit être pesé individuellement à la naissance ou peu après, puis au moins une fois par semaine pendant l'allaitement, et au moins toutes les deux semaines par la suite. Pour évaluer la maturité sexuelle, il faut déterminer l'âge et la masse corporelle de l'animal à l'apparition de la perméabilité vaginale (36) ou de la séparation prépuciale (37) sur au moins un mâle et une femelle par portée.

Ontogénie comportementale

34. L'ontogénie des comportements sélectionnés doit être mesurée sur au moins un petit/sexe/portée pendant la période d'âge appropriée, et sur les mêmes petits à toutes les dates d'essai pour tous les comportements évalués. Il convient d'espacer uniformément les dates de mesure sur cette période, afin de déterminer si la modification de l'ontogénie de ce comportement est normale ou liée au traitement (38). Quelques exemples de comportements susceptibles de donner lieu à une évaluation de l'ontogénie sont les suivants: réflexe de redressement, géotaxie négative et activité motrice (38) (39) (40).

Activité motrice

35. L'activité motrice doit être suivie (41) (42) (43) (44) (45) pendant la période préalable au sevrage et à l'âge adulte. La mise en œuvre de l'essai au moment du sevrage est décrite au paragraphe 32. La longueur de la session d'essai doit permettre de démontrer l'accoutumance intrasession des témoins non traités. Il est vivement recommandé d'utiliser l'activité motrice pour évaluer l'ontogénie comportementale. Dans un essai d'ontogénie comportementale, il faut utiliser les mêmes animaux dans toutes les sessions d'essai préalables au sevrage. Les observations doivent être suffisamment fréquentes pour permettre d'évaluer l'ontogénie de l'accoutumance intrasession (44). À cet effet, l'essai peut demander trois examens ou davantage avant le sevrage, jour du sevrage compris (par exemple JAN 13, 17, 21). Il convient également d'analyser les mêmes animaux, ou des animaux de la fratrie, à l'âge adulte vers la fin de l'étude (par exemple à JAN 60-70). Si nécessaire, des dates d'essai peuvent être ajoutées. L'activité motrice doit être contrôlée par un appareil d'enregistrement automatique capable de détecter aussi bien des augmentations que des diminutions d'activité (c'est-à-dire que l'activité de base mesurée par le dispositif ne doit pas être trop modérée, ce qui empêcherait la détection des diminutions d'activité, ni trop élevée, ce qui empêcherait la détection d'augmentations). Tous les appareils seront testés par des protocoles standard afin de garantir, dans la mesure du possible, la reproductibilité entre appareils et entre dates de mesure. Il conviendra d'équilibrer au mieux les groupes de traitement affectés à chaque appareil. Chaque animal doit être testé individuellement. Il faut répartir les groupes d'évaluation de l'essai sur la journée pour tenir compte des rythmes d'activité circadiens. On s'attachera particulièrement à réduire au minimum les variations affectant les conditions de l'essai et à éviter de les rattacher systématiquement au traitement. Les variables susceptibles d'affecter de nombreuses mesures du comportement, notamment l'activité motrice, comprennent l'intensité du bruit, les dimensions et la forme de la cage de l'essai, la température, l'humidité relative, les conditions de luminosité, les odeurs, l'utilisation de la cage d'habitation pour les tests ou d'une nouvelle cage d'essai et les distractions dues à l'environnement.

Fonction motrice et sensorielle

36. Les fonctions motrices et sensorielles doivent être étudiées en détail au moins une fois pendant la période de l'adolescence et une fois à l'âge jeune adulte (par exemple JAN 60-70). Pour procéder aux essais au moment du sevrage, se reporter au paragraphe 32. Il convient de mener les expériences en nombre suffisant pour garantir un échantillonnage quantitatif approprié des modalités sensorielles (par exemple somato-sensorielle, vestibulaire) et des fonctions motrices (par exemple force, coordination). La réponse à la poussée (46), le réflexe de redressement (47) (48), l'accoutumance au sursaut auditif (40) (49) (50) (51) (52) (53) (54), et les potentiels évoqués (55) comptent parmi les exemples de tests des fonctions motrices et sensorielles.

Essais d'apprentissage et de mémoire

37. Un essai d'apprentissage associatif et de mémoire doit être mené après le sevrage (par exemple 25 ± 2 jours) et chez les jeunes adultes (JAN 60 et plus). Pour ce qui est de l'essai au moment du sevrage, on se reportera au paragraphe 32. Il est possible d'utiliser des essais identiques ou différents aux deux stades de développement. Le choix du ou des essais d'apprentissage et de mémoire chez les rats sevrés et adultes reste relativement libre, mais les tests doivent satisfaire deux critères. Tout d'abord, l'apprentissage doit être évalué soit comme un changement au cours de plusieurs tests ou sessions répétées d'apprentissage, ou bien, dans des essais mettant en œuvre un seul test, par référence à une condition expérimentale qui contrôle les effets non associatifs de l'entraînement. De plus, le ou les essais doivent inclure une mesure de la mémoire (à court terme ou à long terme) en plus de l'apprentissage initial (acquisition), mais cette mesure de mémoire n'a pas lieu d'être rapportée si une mesure d'acquisition n'a pas été obtenue dans le même essai. Dans le cas où le ou les essais d'apprentissage et de mémoire démontrent un effet de la substance d'essai, il convient d'envisager l'utilisation d'autres tests visant à éliminer toute interprétation fondée sur des altérations des capacités sensorielles, de motivation et/ou motrices. Outre ces deux critères, il est recommandé de choisir l'essai d'apprentissage et de mémoire en tenant compte de sa sensibilité démontrée à la classe de la substance chimique à l'étude, dans la mesure où cette information est disponible dans la littérature. Si elle ne l'est pas, la liste ci-dessous propose des tests qui peuvent être réalisés pour satisfaire aux critères mentionnés plus haut dans ce paragraphe: test d'évitement passif (43) (56) (57), appariement retardé de la position pour le rat adulte (58) et pour le rat avant sevrage (59), conditionnement olfactif (43) (60), labyrinthe d'eau de Morris (61) (62) (63), labyrinthe de Biel ou de Cincinnati (64) (65), labyrinthe à bras radiaux (66), labyrinthe en T (43), acquisition et rétention d'un comportement programmé (26) (67) (68). D'autres essais décrits dans la littérature s'appliquent aux rats sevrés (26) (27) et adultes (19) (20).

Autopsie

38. Les mères peuvent être euthanasiées après sevrage de leur progéniture.

39. L'évaluation neuropathologique des descendants sera menée sur des tissus prélevés sur des animaux humainement sacrifiés au JAN 22 ou plus tôt dans l'étude, entre JAN 11 et JAN 22, et également à la fin de l'étude. Les tissus cérébraux doivent être examinés sur les petits sacrifiés jusqu'au JAN 22; sur les animaux sacrifiés à la fin de l'étude, on évaluera les tissus du système nerveux central (SNC) et du système nerveux périphérique (SNP). Les tissus des animaux sacrifiés au JAN 22 ou plus tôt peuvent être fixés par immersion ou perfusion. Ceux des animaux tués à la fin de l'étude doivent être fixés par perfusion. Tous les aspects de la préparation des échantillons de tissus, depuis la perfusion des animaux jusqu'à la dissection des échantillons de tissus, au traitement des tissus et à la coloration des lames, devront respecter un plan expérimental contrebalancé tel que chaque lot contienne des échantillons représentatifs de chaque groupe de dose. Le document d'orientation no 20 de l'OCDE (9) contient des informations supplémentaires sur la neuropathologie [voir également (103)].

Traitement des échantillons de tissus

40. Toutes les anomalies macroscopiques évidentes au moment de l'autopsie doivent être consignées. Les échantillons de tissus prélevés doivent représenter les principales régions du système nerveux. Les échantillons sont conservés dans un fixateur approprié et traités en suivant des protocoles histologiques publiés normalisés (69) (70) (71) (103). L'inclusion dans la paraffine est acceptée pour les tissus du SNC et du SNP, mais l'utilisation d'osmium lors de la postfixation, associée à des inclusions dans une résine époxy, convient parfois mieux lorsqu'un degré plus élevé de résolution est requis (par exemple pour les nerfs périphériques, en cas de suspicion d'une neuropathie périphérique ou pour une analyse morphométrique des nerfs périphériques). Les tissus cérébraux prélevés à des fins d'analyse morphométrique doivent être inclus dans un milieu approprié, simultanément pour toutes les doses, afin d'éviter les artefacts de rétrécissement parfois associés à un stockage prolongé dans le fixateur (6).

Examen neuropathologique

41. L'examen qualitatif a les objectifs suivants:

Des coupes histologiques représentatives des échantillons de tissus doivent être examinées au microscope par un pathologiste de formation adéquate afin de détecter des altérations neuropathologiques. Toutes les altérations détectées seront caractérisées par un degré de gravité subjectif. Une coloration hématoxyline et éosine suffisent souvent pour évaluer les coupes de cerveau des animaux humainement sacrifiés à JAN 22 ou plus tôt. Toutefois, une coloration de la myéline (par exemple fast blue luxol/violet de crésyl) et une coloration à l'argent (par exemple colorations de Bielschowsky ou de Bodians) sont recommandées pour les coupes de tissus du SNC et du SNP prélevés sur les animaux sacrifiés à la fin de l'étude. Le pathologiste appréciera, en s'appuyant sur son expérience professionnelle et sur la nature des altérations observées, s'il convient d'utiliser d'autres colorations afin de repérer et de caractériser des types d'altérations particuliers [par exemple protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) ou histochimie de la lectine pour estimer les altérations gliales et microgliales (72), fluoro-jade pour détecter les nécroses (73) (74), ou coloration à l'argent spécifique de la dégénérescence neurale (75)].

42. Il convient d'effectuer une évaluation morphométrique (quantitative), car ces données peuvent contribuer à détecter un effet lié au traitement et sont utiles à l'interprétation des différences liées au traitement au niveau du poids du cerveau ou de la morphologie (76) (77). Des échantillons de tissu nerveux sont prélevés et préparés en vue d'une évaluation morphométrique. Il faut inclure, par exemple, des mesures linéaires ou surfaciques de régions spécifiques du cerveau (78). De telles mesures se pratiquent sur des coupes homologues soigneusement sélectionnées grâce à des repères microscopiques fiables (6). La stéréologie peut permettre d'identifier des effets liés au traitement sur des paramètres tels que le volume ou le nombre de cellules spécifiques de régions neuroanatomiques (79) (80) (81) (82) (83) (84).

43. On recherchera par l'examen des cerveaux tous les indices d'altérations neuropathologiques associés au traitement, sur des échantillons adéquats prélevés dans les principales régions du cerveau [par exemple bulbes olfactifs, cortex cérébral, hippocampe, noyaux basaux, thalamus, hypothalamus, mésencéphale (tectum, calotte, pédoncules cérébraux), pont, bulbe rachidien, cervelet], en s'efforçant de procéder à un examen exhaustif. Il est important que les coupes soient prélevées dans le même plan sur tous les animaux. Sur les adultes humainement sacrifiés à la fin de l'étude, il faut prélever des sections représentatives de la moelle épinière et du SNP. Les zones étudiées doivent comprendre l'œil avec le nerf optique et la rétine, la moelle épinière au niveau des renflements cervicaux et lombaires, les fibres de la chaîne dorsale et ventrale, le nerf sciatique proximal, le nerf tibial proximal (au niveau du genou), et les ramifications du nerf tibial au niveau des muscles du mollet. La moelle épinière et les nerfs périphériques doivent être représentés par des sections transversales et longitudinales.

44. L'évaluation neuropathologique doit comprendre un examen permettant de détecter des indices de dommages affectant le développement du système nerveux (6) (85) (86) (87) (88) (89), en plus des altérations cellulaires (par exemple vacuolisation neuronale, dégénérescence, nécrose) et des modifications tissulaires (par exemple gliose, infiltration leucocytaire, formation de kystes). À cet égard, il est important de distinguer les effets liés au traitement des événements normaux du développement qui surviennent habituellement au stade correspondant au moment du sacrifice (90). Quelques exemples d'altérations significatives, indicatrices d'effets préjudiciables au développement sont cités ci-dessous:

Analyse de la relation dose-réponse des altérations neuropathologiques

45. Le protocole suivant est recommandé pour les analyses neuropathologiques qualitatives et quantitatives. Il s'agit d'un protocole par étapes. Premièrement, on compare des coupes du groupe de dose la plus élevée avec celles du groupe témoin. En l'absence d'observations d'altérations neuropathologiques chez les animaux du groupe de dose élevée, aucune autre analyse n'est requise. Si des preuves d'altérations neuropathologiques sont notées dans ce groupe, les animaux des groupes de doses intermédiaire et faible sont examinés. Si l'étude sur le groupe de dose élevée est interrompue par le décès ou l'observation d'une toxicité parasite sur les animaux, il faut rechercher dans les groupes de dose élevée et intermédiaire des altérations neuropathologiques. Si l'on détecte des signes de neurotoxicité dans les groupes de doses inférieures, il convient de mener l'analyse neuropathologique dans ces groupes. Pour toute altération neuropathologique liée au traitement, observée lors des examens qualitatifs ou quantitatifs, il faudra déterminer la nature dose-dépendante de l'incidence, de la fréquence et du degré de gravité des lésions ou des altérations morphométriques, en se basant sur une évaluation de tous les animaux de tous les groupes de doses. Toutes les régions du cerveau présentant un signe quelconque d'altération neuropathologique doivent être incluses dans cette évaluation. Il conviendra, pour chaque type de lésion, de décrire les caractéristiques choisies pour définir les différents degrés de gravité, en indiquant les critères employés pour différencier chaque degré. La fréquence de chaque type de lésion et son degré de gravité doivent être enregistrés et une analyse statistique permettra d'évaluer la nature de la relation dose-réponse. L'utilisation de lames codées est recommandée (91).

RÉSULTATS ET RAPPORTS

Résultats

46. Les données doivent être rapportées individuellement et résumées sous forme de tableau, présentant pour chaque groupe d'essai les types de modification et le nombre de mères, de descendants par sexe et de portées présentant chaque type de modification. Dans le cas d'une exposition postnatale des petits, la voie, la durée et la période d'exposition doivent être indiquées.

Évaluation et interprétation des résultats

47. L'objectif d'une étude de neurotoxicité développementale est de fournir des informations sur les effets d'une exposition répétée à une substance pendant le développement in utero et postnatal précoce. L'étude est axée tant sur la toxicité générale que sur les effets neurotoxiques sur le développement, et c'est pourquoi les résultats de l'étude devront permettre de distinguer les effets neurodéveloppementaux qui apparaissent en l'absence de toxicité maternelle générale de ceux qui ne sont exprimés qu'à des doses également toxiques pour la mère. La complexité des interrelations entre le modèle de l'étude, l'analyse statistique et la signification biologique des résultats exige l'avis d'un expert pour assurer une interprétation correcte des données de neurotoxicité pour le développement (107) (109). L'interprétation des résultats de l'essai observera une approche basée sur le poids de la preuve (20) (92) (93) (94). Il conviendra de discuter les types d'effets comportementaux ou morphologiques observés, s'ils existent, ainsi que les preuves d'une relation dose-réponse. Cette caractérisation doit inclure les données issues de toutes les études d'évaluation de la neurotoxicité pour le développement, en particulier des études épidémiologiques sur l'homme ou des rapports d'études de cas et des études sur animaux expérimentaux (par exemple données toxicocinétiques, informations sur la relation structure-activité, données issues d'autres études de toxicité). Cela comprend aussi les relations entre les doses de la substance d'essai et la présence ou l'absence, l'incidence et l'ampleur d'effets neurotoxiques, quels qu'ils soient, sur chaque sexe (20) (95).

48. L'évaluation des résultats comprendra une discussion analysant la signification biologique et la signification statistique. L'analyse statistique doit être considérée comme un outil orientant l'interprétation des données sans la déterminer totalement. Une signification statistique ne permet pas de conclure à elle seule, si elle est nulle, à l'absence d'effet lié au traitement, ni, si elle est positive, à un effet lié au traitement. Afin de se prémunir contre l'observation d'éventuels faux négatifs et contre les difficultés inhérentes à la “démonstration d'un résultat négatif”, il conviendra d'inclure dans la discussion des données de témoins positifs et historiques, en particulier dans le cas d'absence d'effets liés au traitement (102) (106). La probabilité d'obtention de faux positifs doit faire l'objet d'une analyse dans le cadre de l'évaluation statistique générale des résultats (96). L'évaluation doit inclure, le cas échéant, la relation entre les altérations neuropathologiques et comportementales observées.

49. Tous les résultats devront être analysés en utilisant des modèles statistiques adaptés au protocole expérimental (108). Le choix d'une analyse paramétrique ou non paramétrique doit être justifié en tenant compte de facteurs tels que la nature des données (transformées ou non) et leur distribution, mais aussi de la robustesse relative de l'analyse statistique utilisée. Le choix des analyses statistiques doit être guidé par l'objectif et le modèle de l'étude de façon à limiter autant que possible les erreurs de type I (faux positifs) et de type II (faux négatifs) (96) (97) (104) (105). Si les études sur le développement font appel à des espèces multipares dans lesquelles plusieurs petits par portée sont soumis à l'essai, la portée doit être incluse dans le modèle statistique pour éviter l'accroissement des taux d'erreurs de type I (98) (99) (100) (101). L'unité statistique de la mesure doit alors être la portée et non le petit. Les modèles expérimentaux doivent éviter le traitement d'individus de la même portée dans des observations indépendantes. Des effets mesurés à plusieurs reprises sur le même sujet, quels qu'ils soient, doivent être analysés à l'aide de modèles statistiques qui tiennent compte de la non-indépendance de ces mesures.

Rapport d'essai

50. Le rapport d'essai doit comporter les informations ci-après:

Substance d'essai

Véhicule (le cas échéant)

Animaux expérimentaux

Conditions expérimentales

Observations et protocoles d'essai

Résultats (individuels et globaux, avec moyenne et variance, le cas échéant)

Discussion des résultats

Conclusions

BIBLIOGRAPHIE

Figure 1

Schéma général des essais fonctionnels et comportementaux, de l'évaluation neuropathologique et de la mesure des poids des cerveaux. Ce diagramme s'appuie sur la description présentée dans les paragraphes 13-15 (JAN = jour après la naissance). Des exemples de répartition des animaux sont donnés dans l'appendice 1

Environ 20 portées/groupe

Descendants: environ 80/sexe/groupe:

Sélectionnés à JAN 4 ou avant pour les études présevrage et postsevrage:

Observations cliniques et poids corporel (tous les animaux)

Observations cliniques détaillées (20/sexe/groupe)

Ontogénie comportementale (20/sexe/groupe)

Activité motrice (20/sexe/groupe)

Maturation sexuelle (20/sexe/groupe)

Fonction motrice et sensorielle (20/sexe/groupe)

Apprentissage et mémoire (10-20/sexe/groupe)

Neuropathologie: JAN 11-22

10/sexe/groupe:

Fixation par immersion ou perfusion des cerveaux pour l’évaluation neuropathologique. Poids du cerveau (fixé).

Option: essai supplémentaire

10/sexe/groupe:

Poids du cerveau (non fixé).

Neuropathologie: JAN 70 (fin de l’étude)

10/sexe/groupe:

Fixation par perfusion des cerveaux pour l’évaluation neuropathologique.

10/sexe/groupe:

Poids du cerveau (non fixé).

Neuropathologie non exigée.

40-50/sexe/groupe:

Option: essai supplémentaire

B.54. BIOESSAI UTÉROTROPHIQUE CHEZ LES RONGEURS: ESSAI DE DÉPISTAGE À COURT TERME DES PROPRIÉTÉS ŒSTROGÉNIQUES

INTRODUCTION

1. La présente méthode d'essai est équivalente à la ligne directrice pour les essais de produits chimiques no 440 (2007) de l'OCDE. L'OCDE a lancé, en 1998, une activité à caractère hautement prioritaire destinée à réviser les lignes directrices existantes et à établir une nouvelle ligne directrice concernant le dépistage des substances susceptibles d'avoir des effets perturbateurs sur le système endocrinien (1). L'un des éléments de cette activité a été de développer une ligne directrice relative au bioessai utérotrophique chez le rongeur. Le bioessai utérotrophique chez le rongeur a donc fait l'objet d'un programme de validation très complet comprenant l'établissement d'un document de référence détaillé (2) (3) et la conduite d'études intra- et interlaboratoires très complètes, destinées à montrer la pertinence et la reproductibilité du bioessai réalisé avec un puissant œstrogène de référence, des agonistes faibles des récepteurs œstrogéniques, un puissant antagoniste des récepteurs œstrogéniques, et une substance chimique de référence négative (4) (5) (6) (7) (8) (9). La présente méthode d'essai B.54 a été établie à la lumière de l'expérience acquise durant le programme de validation de l'essai et des résultats obtenus concernant les agonistes des œstrogènes.

2. Le bioessai utérotrophique est un essai de dépistage à court terme qui remonte aux années 30 (27) (28) et qui a été normalisé pour la première fois en 1962 aux fins du dépistage par une commission d'experts (32) (35). Cet essai se fonde sur l'augmentation du poids utérin, encore appelée réponse utérotrophique (voir 29). Il évalue la capacité d'une substance chimique à provoquer une activité biologique analogue à celle des agonistes ou antagonistes des œstrogènes naturels (17ß-estradiol par exemple), mais il est toutefois beaucoup plus rarement utilisé pour la détection d'antagonistes que d'agonistes. L'utérus réagit aux œstrogènes de deux façons. La réponse initiale est un accroissement pondéral dû à l'absorption d'eau. Cette réaction est suivie par une augmentation du poids due à la croissance tissulaire (30). La réaction de l'utérus chez le rat et la souris est qualitativement comparable.

3. Ce bioessai sert de test de dépistage in vivo et son application doit être envisagée dans le contexte du “Cadre conceptuel de l'OCDE pour les essais et l'évaluation des perturbateurs endocriniens” (appendice 2). Dans ce cadre conceptuel, le bioessai utérotrophique intervient au niveau 3 en tant qu'essai in vivo fournissant des données sur un seul mécanisme endocrinien, à savoir le pouvoir œstrogénique.

4. Le bioessai utérotrophique est censé faire partie d'une batterie d'essais in vitro et in vivo destinés à identifier les substances susceptibles d'agir sur le système endocrinien, pour permettre à terme d'évaluer les risques pour la santé humaine ou l'environnement. Le programme de validation de l'OCDE a utilisé des agonistes œstrogéniques puissants et faibles pour évaluer l'aptitude de l'essai à identifier les composés œstrogéniques (4) (5) (6) (7) (8). La sensibilité de la procédure d'essai aux agonistes œstrogéniques a pu ainsi être démontrée, de même que sa bonne reproductibilité intra- et interlaboratoire.

5. En ce qui concerne les substances chimiques négatives, seule une substance chimique de référence “négative” déjà identifiée comme telle par l'essai utérotrophique et les essais in vitro de liaison avec les récepteurs a été incluse dans le programme de validation, mais des données complémentaires, extérieures au programme de validation de l'OCDE, ont été évaluées, et ont confirmé la spécificité du bioessai utérotrophique pour le dépistage d'agonistes des œstrogènes (16).

CONSIDÉRATIONS INITIALES ET LIMITATIONS

6. Les agonistes et antagonistes des œstrogènes agissent comme ligands des récepteurs œstrogéniques α et β et peuvent respectivement activer ou inhiber l'activité transcriptionnelle des récepteurs. Cela peut avoir des conséquences négatives pour la santé, notamment des effets sur la reproduction et le développement. Il est donc nécessaire d'évaluer rapidement les substances chimiques pour déterminer leur éventuelle activité agoniste ou antagoniste des œstrogènes. Bien qu'instructive, l'affinité d'un ligand et d'un récepteur œstrogénique ou l'activation transcriptionnelle des gènes rapporteurs in vitro ne représente qu'un déterminant, parmi plusieurs, d'un danger possible. Les autres facteurs déterminants peuvent être l'activation et la désactivation métaboliques lors de l'entrée dans l'organisme, la distribution entre les tissus cibles et l'élimination de l'organisme, qui dépendent, au moins en partie, de la voie d'administration et de la substance d'essai. Il est par conséquent nécessaire de dépister l'activité éventuelle d'une substance chimique in vivo dans des conditions appropriées, sauf si les caractéristiques ADME (absorption, distribution, métabolisme, élimination) de la substance chimique fournissent déjà les informations indispensables. Les tissus utérins réagissent aux œstrogènes par une croissance rapide et vigoureuse, notamment chez les rongeurs de laboratoire, dont le cycle œstral dure environ 4 jours. Les rongeurs, en particulier le rat, sont aussi largement utilisés dans les études de toxicité pour caractériser les dangers. En conséquence, l'utérus des rongeurs est un organe cible approprié pour le dépistage in vivo des agonistes et antagonistes des œstrogènes.

7. La présente méthode d'essai s'appuie sur les protocoles employés dans l'étude de validation de l'OCDE qui se sont révélés fiables et reproductibles dans les études intra- et interlaboratoires (5) (7). À l'heure actuelle deux méthodes sont disponibles, l'une utilisant des femelles adultes ovariectomisées (méthode adulte-ovx) et l'autre, des animaux immatures, non ovariectomisés (méthode immature). Le programme de validation des essais de l'OCDE a montré que la sensibilité et la reproductibilité de ces deux méthodes étaient comparables. Cependant, la méthode sur des femelles immatures, dont l'axe hypothalamo-pituito-gonadique (HPG) est intact, est peut-être moins spécifique mais couvre un plus large champ d'investigation que celle pratiquée sur des animaux ovariectomisés, parce qu'elle est sensible à des substances qui interagissent avec l'axe HPG et non pas uniquement avec les récepteurs aux œstrogènes. L'axe HPG de la rate est fonctionnel à partir d'environ 15 jours après la naissance. Avant cet âge, la puberté ne peut pas être accélérée par des traitements comme la GnRH. À l'approche de la puberté, avant l'ouverture du vagin, la femelle a plusieurs cycles silencieux sans ouverture vaginale ni ovulation, mais qui se manifestent par certaines fluctuations hormonales. Si une substance chimique stimule l'axe HPG directement ou indirectement durant cette période, on assiste à une puberté précoce, une ovulation précoce ou une ouverture vaginale accélérée. Les substances chimiques agissant sur l'axe HPG produiront cet effet, mais également certains régimes à niveaux d'énergie métabolisable plus élevés que les autres stimuleront la croissance et accéléreront l'ouverture vaginale sans être œstrogéniques. Ces substances n'induiront pas de réponse utérotrophique chez les animaux adultes ovariectomisés puisque leur axe HPG ne fonctionne pas.

8. Dans un souci de protection des animaux, on privilégiera la méthode pratiquée sur des rates immatures pour éviter le prétraitement chirurgical des animaux et le risque de ne pas pouvoir utiliser les animaux manifestant des signes de préœstrus (voir le paragraphe 30).

9. La réponse utérotrophique n'est pas entièrement d'origine œstrogénique, d'autres substances chimiques que les agonistes ou antagonistes des œstrogènes peuvent aussi intervenir. Par exemple, des doses relativement élevées de progestérone, de testostérone ou de diverses progestines synthétiques peuvent aussi induire une stimulation (30). Toutes les réactions peuvent faire l'objet d'une analyse histologique indiquant une kératinisation et une cornification du vagin (30). Indépendamment de l'origine possible de la réponse, tout bioessai utérotrophique positif doit normalement donner lieu à des recherches plus poussées, permettant d'apporter des clarifications. Le pouvoir œstrogénique peut être confirmé par des essais in vitro, notamment par des essais de liaison avec les récepteurs ER et des essais d'activation transcriptionnelle, ou par d'autres essais in vivo, notamment l'essai de puberté chez les femelles.

10. Sachant que le bioessai utérotrophique sert d'essai de dépistage in vivo, la méthode de validation adoptée a pris en compte le bien-être des animaux et retenu une stratégie d'essai par étapes. À cette fin, des efforts ont été déployés pour valider de façon rigoureuse la reproductibilité et la sensibilité du dépistage du pouvoir œstrogénique (problème majeur pour beaucoup de substances chimiques), mais peu de travaux ont été consacrés à la composante antiœstrogénique de l'essai. Un seul antiœstrogène, puissant, a été testé, étant donné que le nombre de substances chimiques possédant un profil clairement antiœstrogénique (qui ne soit pas masqué par une activité œstrogénique) est très limité. En conséquence, la présente méthode d'essai est dédiée au protocole œstrogénique, tandis que le protocole décrivant le mode antagoniste de l'essai figure dans un document d'orientation (37). La reproductibilité et la sensibilité de l'essai pour les substances chimiques ayant une activité purement antiœstrogénique seront mieux définies ultérieurement, lorsque la procédure d'essai aura été utilisée de façon routinière pendant assez longtemps et que davantage de substances présentant ce mode d'action auront été identifiées.

11. Il est reconnu que toutes les procédures faisant appel à des animaux respecteront les normes locales en matière de bien-être animal; les descriptifs des soins et traitements figurant ci-après constituent donc des normes minimales auxquelles se substitueront les réglementations locales telles que la directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (38). D'autres orientations relatives au traitement humain des animaux ont été formulées par l'OCDE (25).

12. Comme dans tous les essais faisant appel à des animaux vivants, il est indispensable de s'assurer que les données sont réellement nécessaires avant de commencer l'essai. À titre d'exemple, des données peuvent être réellement nécessaires dans les deux situations suivantes:

13. La définition des termes utilisés dans la présente méthode d'essai figure à l'appendice 1.

PRINCIPE DE L'ESSAI

14. La sensibilité du bioessai utérotrophique exige un dispositif d'essai dans lequel l'axe hypothalamo-pituito-ovarien n'est pas fonctionnel, d'où de faibles niveaux d'œstrogènes endogènes en circulation. Cela garantira un poids utérin de référence peu élevé et le plus large éventail possible de réponses aux œstrogènes administrés. Les rongeurs femelles remplissent ces conditions dans deux cas:

15. La substance d'essai est administrée chaque jour par gavage oral ou injection sous-cutanée. Des doses modulées de la substance d'essai sont administrées à au moins deux groupes d'animaux (pour plus de précisions voir le paragraphe 33); on applique un niveau de dose par groupe; la période d'administration est de 3 jours consécutifs dans la méthode sur femelles immatures et d'au minimum 3 jours consécutifs dans la méthode sur femelles adultes ovariectomisées. Les animaux sont sacrifiés environ 24 heures après l'administration de la dernière dose. Pour dépister les agonistes des œstrogènes, on mesure le rapport entre le poids utérin moyen des animaux des groupes d'essai et celui des animaux du groupe témoin qui a reçu le véhicule pour déterminer s'il existe une augmentation statistiquement significative. Une augmentation statistiquement significative du poids utérin moyen d'un groupe d'essai indique une réponse positive à ce bioessai.

DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

Sélection de l'espèce animale

16. Les souches de rongeurs utilisées communément en laboratoire peuvent convenir. Par exemple, les souches de rats Sprague-Dawley et Wistar ont été utilisées pour la validation. Il conviendra de ne pas utiliser les souches pour lesquelles on sait ou on suspecte que l'utérus est moins réactif. Le laboratoire doit démontrer la sensibilité de la souche utilisée comme indiqué aux paragraphes 26 et 27.

17. Depuis les années 30, le rat et la souris sont utilisés de façon routinière pour le bioessai utérotrophique. Les études de validation de l'OCDE ont été effectuées seulement sur des rats, étant entendu que ces deux espèces sont en principe équivalentes et qu'une seule devrait suffire pour la validation mondiale, l'idée étant d'économiser les ressources et de préserver les animaux. L'espèce retenue pour la plupart des études de toxicité pour la reproduction et le développement est le rat. Sachant qu'on dispose d'une riche base de données rétrospectives concernant la souris et, pour élargir le champ d'application de la méthode d'essai relative au bioessai utérotrophique chez les rongeurs, une étude de validation complémentaire limitée a été effectuée sur la souris (16). On a adopté une approche comparative faisant intervenir un nombre limité de substances d'essai et de laboratoires, sans tests d'échantillons codés, de façon à respecter l'intention première d'économiser les ressources et de préserver les animaux. L'étude comparative de validation du bioessai utérotrophique chez la jeune femelle de souris adulte ovariectomisée indique une bonne correspondance qualitative et quantitative des données obtenues chez le rat et chez la souris. Lorsque les résultats du bioessai utérotrophique sont obtenus préalablement à une étude à long terme, cela permet d'utiliser les animaux de la même souche et de la même source dans les deux études. L'approche comparative n'a été utilisée que sur la souris ovariectomisée et l'ensemble de données fournies dans le rapport n'est pas assez solide pour valider le modèle sur la souris femelle immature, c'est pourquoi ce modèle n'entre pas dans le champ d'application de la présente méthode d'essai.

18. Ainsi, dans certains cas, la souris pourra être utilisée à la place du rat. Ce choix devra être justifié par des données toxicologiques, pharmacocinétiques et/ou par d'autres critères. Il pourra nécessiter certaines modifications du protocole. Par exemple, la consommation alimentaire d'une souris rapportée à son poids corporel est plus élevée que celle d'une rate, c'est pourquoi la quantité de phytœstrogènes contenue dans les aliments devra être plus faible pour la souris que pour le rat (9) (20) (22).

Conditions d'élevage et d'alimentation

19. Toutes les procédures doivent être conformes aux normes locales relatives à l'entretien des animaux de laboratoire. Les conditions d'entretien et de traitement décrites ici sont des normes minimales et seront remplacées par la réglementation applicable, notamment la directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (38). La température du local expérimental doit être de 22 °C (± 3 °C). Le taux d'humidité relative devrait être d'au moins 30 % et, de préférence, ne pas dépasser 70 % en dehors des heures de nettoyage du local. On s'efforcera de maintenir le taux d'humidité entre 50 et 60 %. Un éclairage artificiel est utilisé. La séquence doit être de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité.

20. Les animaux recevront de la nourriture et de l'eau potable à volonté. Les jeunes animaux adultes peuvent être placés dans des cages individuelles ou collectives pouvant contenir jusqu'à 3 individus. Compte tenu de leur jeune âge, les animaux immatures seront de préférence placés dans des cages collectives.

21. On sait que les aliments pour animaux de laboratoire contenant des niveaux élevés de phytœstrogènes font augmenter le poids utérin chez les rongeurs dans des proportions suffisantes pour interférer avec le bioessai utérotrophique (13) (14) (15). Des taux élevés de phytœstrogènes et d'énergie métabolisable dans la nourriture de laboratoire peuvent aussi induire une puberté précoce si l'on utilise des animaux immatures. La présence de phytœstrogènes résulte principalement de l'inclusion de soja et d'alfalfa dans les mélanges de laboratoire, et il a été constaté que les concentrations de phytœstrogènes variaient selon les lots de mélange standard (23). Le poids corporel est une variable importante, étant donné que la quantité de nourriture consommée lui est corrélée. Par conséquent, la dose de phytœstrogène effectivement consommée avec le même régime peut varier selon les espèces et les âges (9). En ce qui concerne les rats femelles immatures, la consommation alimentaire rapportée au poids corporel peut représenter près du double de celle des jeunes femelles adultes ovariectomisées. Pour les jeunes souris adultes, la consommation alimentaire rapportée au poids corporel peut représenter environ quatre fois celle des jeunes rates adultes ovariectomisées.

22. Les résultats du bioessai utérotrophique (9) (17) (18) (19) indiquent toutefois que de faibles quantités de phytœstrogènes sont acceptables dans la nourriture et ne réduisent pas la sensibilité du bioessai. À titre indicatif, les quantités de phytœstrogènes dans les aliments ne doivent pas dépasser 350 μg d'équivalents génistéine/gramme de mélange de laboratoire pour les rates immatures Sprague Dawley et Wistar (6) (9). Ce régime devrait aussi convenir pour les essais sur les jeunes rates adultes ovariectomisées, car la consommation de nourriture rapportée au poids corporel est moins importante chez les jeunes adultes que chez les animaux immatures. Si l'on doit utiliser des souris adultes ovariectomisées ou des rates plus sensibles aux phytœstrogènes, il faudra envisager de réduire les niveaux de phytœstrogènes en conséquence (20). De plus, les quantités différentes d'énergie métabolisable dans les différents régimes peuvent décaler le début de la puberté (21) (22).

23. Avant de commencer l'étude, le régime alimentaire sera soigneusement établi en veillant à éviter les taux élevés de phytœstrogènes [voir (6) (9)] ou d'énergie métabolisable, qui peuvent fausser les résultats (15) (17) (19) (22) (36). Il importe de contrôler ces deux facteurs pour assurer la bonne marche du dispositif d'essai utilisé par le laboratoire conformément aux paragraphes 26 et 27. Par mesure de sécurité et en application des bonnes pratiques de laboratoire, un échantillon représentatif de chaque lot de nourriture administré durant l'étude sera prélevé pour permettre une analyse de la présence de phytœstrogènes (par exemple en cas de poids utérin élevé chez les animaux témoins par rapport aux données précédentes, ou de réponse inadéquate à l'œstrogène de référence, 17α-éthinylestradiol). Les aliquotes doivent être analysées dans le cadre de l'étude ou congelées à – 20 °C ou conservées selon une méthode permettant d'éviter que l'échantillon ne se décompose avant analyse.

24. Certains types de litières peuvent contenir des substances œstrogéniques ou antiœstrogéniques à l'état naturel (par exemple, on sait que la rafle de maïs influe sur le cycle des rates et pourrait avoir des effets antiœstrogéniques). Le type de litière choisi devra contenir le moins possible de phytœstrogènes.

Préparation des animaux

25. Les animaux d'expérience, choisis après avoir vérifié qu'ils ne présentent pas de signes de maladie ni d'anomalie physique, sont répartis au hasard entre les groupes traités et le groupe témoin. Les cages doivent être disposées de façon à réduire le plus possible les effets éventuels de leur emplacement. Les animaux sont marqués pour permettre une identification individuelle. Pendant la période d'acclimatation, les animaux immatures doivent être gardés dans des cages avec leurs mères ou d'autres femelles allaitantes jusqu'à ce qu'ils soient sevrés. La période d'acclimatation précédant le début de l'expérience doit durer environ 5 jours pour les jeunes femelles adultes et pour les animaux immatures livrés avec leur mère ou d'autres femelles. Si les animaux immatures sont livrés sans leur mère et déjà sevrés, la période d'acclimatation devra être plus courte puisque l'administration doit commencer immédiatement après le sevrage (voir le paragraphe 29).

PROCÉDURE

Vérification des compétences du laboratoire

26. Deux options sont possibles pour vérifier les compétences d'un laboratoire:

Si le dispositif ne produit pas la réponse attendue, les conditions expérimentales devront être revues et modifiées en conséquence. Pour les deux approches, la dose de l'œstrogène de référence recommandée doit correspondre approximativement à la dose efficace 70 à 80.

27. Étude de référence — témoin positif: Avant d'effectuer pour la première fois une étude suivant la présente méthode d'essai, chaque laboratoire doit démontrer ses compétences en testant la sensibilité du modèle animal et en établissant la relation dose-effet pour un œstrogène de référence, le 17α-éthinylestradiol (no CAS 57-63-6) (EE) avec au minimum quatre doses. L'effet sur le poids utérin sera comparé aux données historiques attestées [voir référence (5)]. Si l'étude de référence ne donne pas les résultats escomptés, les conditions de l'expérience devront être revues et modifiées.

Nombre et répartition des animaux

28. Chaque groupe d'essai et de référence doit comprendre au moins 6 animaux (pour les protocoles des méthodes sur femelles immatures et ovariectomisées).

Âge des animaux immatures

29. Pour le bioessai utérotrophique pratiqué sur des animaux immatures, le jour de la naissance doit être spécifié. L'administration de la substance d'essai doit commencer assez tôt pour faire en sorte que, à la fin de la période d'administration, l'augmentation physiologique des œstrogènes endogènes associée à la puberté n'ait pas commencé. D'un autre côté, il a été constaté que les très jeunes animaux peuvent être moins réactifs. Pour définir l'âge optimal des animaux d'essai, chaque laboratoire doit se reporter à son corpus de données de référence sur la maturation.

En règle générale, le traitement des rats peut commencer immédiatement après un sevrage précoce, au jour 18 après la naissance (le jour de la naissance étant le jour 0). Il doit s'arrêter de préférence au jour 21 après la naissance, mais dans tous les cas avant le jour 25 après la naissance, car, au-delà, l'axe hypothalamo-pituito-ovarien devient fonctionnel et les taux d'œstrogènes endogènes peuvent commencer à augmenter avec accroissement concomitant des poids utérins moyens et augmentation des écarts types (2) (3) (10) (11) (12).

Procédure d'ovariectomie

30. Dans l'essai sur les rats et les souris femelles ovariectomisées (groupes d'essai et groupes témoins), l'ovariectomie doit être pratiquée entre 6 et 8 semaines d'âge. Chez le rat, 14 jours au minimum doivent s'écouler entre l'ovariectomie et la première administration afin de permettre la régression de l'utérus à un poids minimum de référence stable. Chez la souris, 7 jours au minimum doivent s'écouler entre l'ovariectomie et le premier jour de traitement. Une petite quantité de tissu ovarien suffit à produire des taux élevés d'œstrogènes en circulation (3), c'est pourquoi les animaux doivent être contrôlés avant l'essai, en observant les cellules épithéliales prélevées dans le vagin pendant au moins 5 jours consécutifs (par exemple du 10e au 14e jour après ovariectomie pour les rates). Si les animaux présentent des signes de préœstrus, ils ne doivent pas être utilisés. Ultérieurement, lors de la nécropsie, les moignons ovariens doivent être examinés pour repérer s'il reste du tissu ovarien. Si c'est le cas, les données de l'animal ne doivent pas être prises en compte dans les calculs (3).

31. L'ovariectomie est opérée sur l'animal couché sur le ventre, qui aura été convenablement anesthésié. La paroi abdominale dorsolatérale est incisée sur environ un centimètre au point médian entre la limite costale inférieure et la crête iliaque, à quelques millimètres de la marge latérale du muscle lombaire. Les ovaires sont extraits de la cavité abdominale, déposés sur un champ aseptique puis détachés au niveau de la jonction de l'oviducte et du corps utérin. Après avoir vérifié qu'aucun saignement important ne se produit, on recoud la paroi abdominale puis la peau est refermée par des autoclips ou par suture. Les points de ligature sont indiqués schématiquement à la figure 1. Une analgésie postopératoire appropriée recommandée par un vétérinaire spécialiste des rongeurs doit être pratiquée.

Poids corporel

32. Dans la méthode sur animaux adultes ovariectomisés, le poids corporel et le poids utérin ne sont pas corrélés parce que le poids utérin est affecté par des hormones telles que les œstrogènes, mais pas par les facteurs de croissance qui régulent la taille du corps. Dans le modèle sur animaux immatures au contraire, le poids corporel est corrélé au poids utérin, pendant la période de maturation (34). Par conséquent, au début de l'étude, la variation pondérale des animaux utilisés, dans le modèle sur animaux immatures, doit être minimale et ne pas excéder± 20 % du poids moyen. Cela signifie que la taille des portées doit être standardisée par l'éleveur pour garantir que les petits de mères différentes sont nourris sensiblement de la même façon. Les animaux sont répartis de façon aléatoire par groupes (témoin et d'essai), de façon à ce qu'il n'y ait aucune différence statistique entre le poids corporel moyen des différents groupes. Il conviendra d'éviter dans la mesure du possible de mettre plusieurs animaux d'une même portée dans le même groupe de traitement, sans que cela fasse augmenter le nombre de portées nécessaires à l'étude.

Dosage

33. Deux groupes de dose et un groupe témoin suffisent habituellement pour établir si une substance d'essai peut avoir une action œstrogénique in vivo, et on préférera donc cette méthode pour des raisons de protection des animaux. Si l'objectif est d'obtenir une courbe de la relation dose-effet ou d'extrapoler les résultats à des doses plus faibles, au moins 3 groupes de dose seront nécessaires. Si l'on souhaite obtenir des informations plus poussées sur l'activité œstrogénique (estimation du pouvoir œstrogénique, par exemple), un autre système de dosage devra être envisagé. Exception faite de l'administration de la substance d'essai, les animaux du groupe témoin devront avoir exactement le même traitement que ceux des groupes d'essai. Si un véhicule est utilisé pour administrer la substance d'essai, le groupe témoin doit recevoir la même quantité du véhicule utilisé que les groupes traités (ou le volume le plus important administré si les groupes ne reçoivent pas les mêmes doses).

34. L'objectif, dans le cas du bioessai utérotrophique, est de choisir des doses qui assurent la survie des animaux et n'entraînent pas de détresse ni d'effets toxiques graves après 3 jours consécutifs d'administration de la substance chimique, jusqu'à une dose maximale de 1 000 mg/kg/j. Tous les niveaux de dose doivent être proposés et sélectionnés à la lumière des données existantes sur la toxicité et le comportement (toxico)-cinétique du composé testé ou des substances de même nature. Le niveau de dose le plus élevé doit être établi tout d'abord en fonction de la DL50 et/ou des informations sur la toxicité aiguë afin d'éviter le décès et la détresse ou la souffrance extrêmes des animaux (24) (25) (26). La dose la plus élevée doit représenter la dose maximale tolérée (MTD); une étude menée avec un niveau de dose ayant induit une réaction utérotrophique positive pourra aussi être acceptée. Pour opérer la sélection, on accepte généralement de larges intervalles entre les dosages (une demi-unité logarithmique, soit un facteur de progression de 3,2 ou même jusqu'à une unité logarithmique). En l'absence de données appropriées, une étude de détermination de l'ordre de grandeur peut être effectuée pour aider à définir les doses qu'il convient d'utiliser.

35. Autre solution, si l'activité œstrogénique d'un agoniste peut être estimée d'après des données in vitro (ou in silico), celles-ci pourront être prises en considération pour établir les doses. Par exemple, la quantité de substance chimique d'essai qui produira une réaction utérotrophique équivalente à celle de l'agoniste de référence (éthinylestradiol) est estimée d'après son activité évaluée in vitro par rapport à celle de l'éthinylestradiol. La dose d'essai la plus élevée sera obtenue en multipliant cette dose équivalente par un facteur adéquat (10 ou 100, par exemple).

Détermination de l'ordre de grandeur

36. Le cas échéant, une étude de détermination de l'ordre de grandeur peut être effectuée sur un petit nombre d'animaux. À cet égard, le document d'orientation de l'OCDE no 19 (25) qui définit les signes cliniques indicateurs de toxicité ou de détresse des animaux peut être utilisé. Si cela est réalisable dans le cadre de cette étude de détermination, après 3 jours de traitement, les utérus peuvent être excisés et pesés environ 24 heures après la dernière dose. Ces données peuvent ensuite être utilisées pour mettre au point l'étude principale (définir les doses maximales et minimales acceptables et recommander le nombre de groupes de dose).

Administration des doses

37. La substance d'essai est administrée par gavage ou injection sous-cutanée. La voie d'administration sera déterminée en tenant compte de considérations relatives au bien-être des animaux, et aux aspects toxicologiques tels que le rapport avec l'exposition humaine à la substance chimique (gavage oral pour une exposition par ingestion, injection sous-cutanée pour une exposition par inhalation ou adsorption cutanée), les propriétés physiques/chimiques de la substance d'essai et surtout les informations toxicologiques existantes et les données sur le métabolisme et le comportement cinétique (par exemple la nécessité d'éviter le métabolisme de premier passage, meilleure efficacité d'une voie d'administration plutôt que d'une autre).

38. Il est recommandé, chaque fois que cela est possible, d'envisager pour commencer l'utilisation d'une solution/suspension aqueuse. Toutefois, les ligands des récepteurs aux œstrogènes ou leurs précurseurs métaboliques sont généralement hydrophobes, c'est pourquoi on utilise le plus souvent une solution/suspension huileuse (huile de maïs, d'arachide, de sésame ou d'olive). Ces différentes huiles n'ont toutefois pas la même valeur calorique, ni la même teneur en matières grasses, c'est pourquoi le véhicule peut influer sur l'apport total d'énergie métabolisable et peut donc potentiellement modifier les paramètres mesurés, notamment le poids utérin, surtout dans la méthode sur animaux immatures (33). Ainsi, avant de commencer l'étude, le véhicule retenu doit être testé au regard de témoins sans véhicule. Les substances d'essai peuvent être dissoutes dans une quantité minimale d'éthanol à 95 % ou d'autres solvants appropriés, puis diluées dans le véhicule de l'essai aux concentrations finales voulues. Les caractéristiques toxiques du solvant doivent être connues et contrôlées sur un groupe témoin traité uniquement avec le solvant. Si la substance d'essai est considérée comme stable, on peut légèrement chauffer le mélange et le soumettre à une action mécanique vigoureuse pour faciliter sa dissolution. La stabilité de la substance d'essai dans le véhicule doit être déterminée. Si la substance d'essai est stable pendant toute la durée de l'étude, une aliquote de la substance d'essai peut être préparée, après quoi les dilutions spécifiées sont préparées quotidiennement.

39. Le calendrier d'administration dépend du modèle d'essai (voir le paragraphe 29 pour l'essai sur animaux immatures et le paragraphe 30 pour l'essai sur animaux ovariectomisés). La substance d'essai est administrée quotidiennement aux rates immatures pendant 3 jours consécutifs. Un traitement de 3 jours est également recommandé pour les rates ovariectomisées, mais des expositions plus longues peuvent être aussi acceptées et favoriser la détection de substances faiblement actives. Sur les souris femelles ovariectomisées, 3 jours de traitement doivent suffire et il ne semble pas très intéressant de porter la durée du traitement à 7 jours pour les agonistes d'œstrogènes puissants; toutefois, l'étude de validation n'a pas permis d'établir cette relation pour les œstrogènes de plus faible activité (16), aussi la durée d'administration doit-elle être prolongée jusqu'à 7 jours consécutifs chez les souris ovariectomisées. Le produit doit être administré chaque jour à heure fixe. L'administration doit se faire de façon à maintenir un niveau de dose constant par rapport au poids corporel des animaux (mg de substance d'essai par kg de poids corporel par jour). On réduira au minimum la variabilité du volume d'essai par rapport au poids corporel en adaptant les concentrations de façon à obtenir un volume constant par rapport au poids corporel à tous les niveaux de doses et pour toutes les voies d'administration.

40. Lorsque la substance d'essai est administrée par gavage, les animaux reçoivent une seule dose quotidienne à l'aide d'une sonde gastrique ou d'une canule d'intubation appropriée. Le volume maximal de liquide pouvant être administré en une fois dépend de la taille de l'animal d'essai. Les directives locales d'entretien des animaux doivent être observées, mais le volume ne doit pas excéder 5 ml/kg de poids corporel, sauf dans le cas de solutions aqueuses où l'on pourra utiliser 10 ml/kg de poids corporel.

41. Lorsque la substance d'essai est administrée par injection sous-cutanée, les animaux reçoivent une seule dose quotidienne. Les doses doivent être injectées dans la région dorso-scapulaire ou lombaire à l'aide d'une aiguille stérile (de calibre 23 ou 25) et d'une seringue tuberculine. Le rasage du site d'injection est facultatif. Toute perte ou fuite au moment de l'injection ou toute administration incomplète doivent être consignées. Le volume total injecté par rate par jour ne doit pas dépasser 5 ml/kg de poids corporel, répartis entre 2 sites d'injection, sauf dans le cas de solutions aqueuses où l'on pourra utiliser 10 ml/kg de poids corporel.

Observations

Observations générales et cliniques

42. Des observations cliniques générales doivent être effectuées au moins une fois par jour, et plus fréquemment si des signes de toxicité sont constatés. Ces observations doivent être effectuées de préférence chaque jour à la (aux) même(s) heure(s) et en tenant compte du moment où les effets devraient être le plus marqués après l'administration des doses. Tous les animaux sont soumis à des observations pour contrôler la mortalité, la morbidité et les signes cliniques généraux tels que les changements de comportement, les changements au niveau de la peau, du pelage, des yeux et des muqueuses, l'apparition de sécrétions et d'excrétions et les activités végétatives (larmoiement, piloérection, taille des pupilles, respiration inhabituelle, par exemple).

Poids corporel et consommation alimentaire

43. Tous les animaux doivent être pesés quotidiennement à 0,1 g près, en commençant juste avant le début du traitement c'est-à-dire au moment de la répartition des animaux par groupes. La quantité de nourriture consommée durant la période de traitement peut aussi être mesurée cage par cage en pesant les distributeurs d'aliments. Ces données d'alimentation facultatives doivent être exprimées en grammes par rat par jour.

Dissection et pesage de l'utérus

44. Vingt-quatre heures après le dernier traitement, les rats sont euthanasiés. Idéalement, le sacrifice est effectué de façon aléatoire entre les groupes pour éviter de faire passer en premier ou en dernier l'un ou l'autre groupe, ce qui pourrait légèrement affecter les données. L'objectif du bioessai est de mesurer le poids des utérus séchés et frais. Le poids frais est celui de l'utérus et du fluide luminal. Le poids “séché” est mesuré après avoir exprimé et éliminé le contenu luminal de l'utérus.

45. Avant la dissection, le vagin sera contrôlé pour repérer une éventuelle ouverture chez les animaux immatures. La procédure de dissection commence par l'ouverture de la paroi abdominale au niveau de la symphyse pubienne. S'ils sont présents, les cornes utérines et les ovaires sont détachés de la paroi abdominale dorsale. La vessie et les uretères sont dégagés de la face ventrale et latérale de l'utérus et du vagin. Les adhérences fibreuses entre le rectum et le vagin sont libérées jusqu'à ce qu'on repère la jonction de l'orifice vaginal et du périnée. L'utérus et le vagin sont détachés du corps par incision de la paroi vaginale juste au-dessus de la jonction du périnée, comme indiqué à la figure 2. L'utérus doit être détaché du corps en découpant soigneusement le mésentère à son point d'attache sur toute la longueur de la façade dorsolatérale de chaque corne. Après extraction de l'utérus, la manipulation doit être assez rapide pour éviter la dessiccation des tissus. La perte de poids due à la dessiccation devient plus importante avec des tissus minces tels que l'utérus (23). S'ils sont présents, les ovaires sont détachés au niveau de l'oviducte en évitant l'écoulement de fluide luminal de la corne utérine. Si l'animal a été ovariectomisé, les cicatrices seront examinées pour repérer l'éventuelle présence de tissu ovarien. La graisse excédentaire et le tissu conjonctif doivent être éliminés. Le vagin est détaché de l'utérus juste à la base du col de l'utérus pour que celui-ci reste solidaire du corps utérin comme indiqué à la figure 2.

46. Chaque utérus doit être transféré dans un récipient pesé portant un marquage individuel (boîte de Petri ou nacelle de pesée en plastique) en continuant de veiller à ce qu'il ne se dessèche pas avant la pesée (un filtre papier légèrement imbibé de solution saline peut être placé au fond du récipient). L'utérus et le fluide luminal seront pesés à 0,1 mg près (poids frais).

47. Chaque utérus sera ensuite traité individuellement pour extraire le fluide luminal. Les deux cornes utérines seront percées ou sectionnées selon un axe longitudinal. L'utérus sera placé sur un filtre en papier légèrement humidifié (Whatman no 3, par exemple) puis comprimé doucement avec un second morceau de filtre en papier légèrement humidifié, jusqu'à élimination complète du fluide luminal. L'utérus vidé de son contenu luminal sera ensuite pesé à 0,1 mg près (poids séché).

48. Le poids utérin en fin d'essai peut être utilisé pour vérifier que les rates immatures intactes n'ont pas dépassé l'âge applicable, bien que les données historiques de la souche utilisée par le laboratoire soient déterminantes à cet égard (voir le paragraphe 56 pour l'interprétation des résultats).

Études optionnelles

49. Après avoir été pesé, l'utérus peut être placé dans du formol à 10 % tamponné à pH neutre pour examen histopathologique après coloration hématoxyline-éosine. Le vagin peut être aussi examiné (voir le paragraphe 9). Des mesures morphométriques peuvent être par ailleurs effectuées sur l'épithélium endométrial pour opérer des comparaisons quantitatives.

DONNÉES ET RAPPORT D'ESSAIS

Données

50. Les informations suivantes doivent être fournies:

51. Les données suivantes doivent être consignées pour chaque animal: poids corporels, poids utérin frais et poids de l'utérus séché. Des analyses statistiques unilatérales pour les agonistes doivent être utilisées pour déterminer si l'administration d'une substance d'essai provoque une augmentation statistiquement significative (p < 0,05) du poids utérin. Les analyses statistiques requises doivent être effectuées pour étudier les modifications liées au traitement, des poids des utérus frais et séchés. Par exemple, les données peuvent être évaluées par une analyse de covariance (ANCOVA), la covariable étant le poids corporel à la nécropsie. Une transformation logarithmique stabilisant la variance peut être opérée sur les données utérines avant l'analyse des données. Le test de Dunnett et Hsu peut être utilisé pour opérer des comparaisons par paires entre les groupes traités et les groupes témoins et pour calculer les intervalles de confiance. Une analyse des résidus studentisés peut permettre de détecter les éventuelles valeurs aberrantes et d'évaluer l'homogénéité des variances. Ces procédures ont été appliquées dans le programme de validation de l'OCDE à l'aide de la PROC GLM du Système d'analyse statistique (SAS Institute, Cary, NC), version 8 (6) (7).

52. Le rapport final doit contenir les informations suivantes:

Établissement réalisant l'essai

Substance d'essai

Véhicule

Animaux d'expérience

Conditions de l'essai

Résultats

Pour chaque animal

Pour chaque groupe d'animaux

53. Résumé des principaux éléments et conditions de la méthode d'essai

ORIENTATIONS POUR L'INTERPRÉTATION ET L'ACCEPTATION DES RÉSULTATS

54. En général, un essai évaluant le pouvoir œstrogénique doit être considéré comme positif si l'on constate une augmentation statistiquement significative du poids utérin (p < 0,05) au moins chez le groupe traité avec la dose la plus élevée par rapport au groupe témoin qui a reçu le solvant. Un résultat positif est confirmé par la démonstration d'une relation biologiquement plausible entre la dose et l'ampleur de l'effet produit, sans perdre de vue que les effets œstrogéniques et antiœstrogéniques conjugués de la substance d'essai peuvent modifier la forme de la courbe dose-effet.

55. Il importe de veiller à ne pas dépasser la dose maximale tolérée pour pouvoir interpréter avec profit les données. La réduction du poids corporel, les signes cliniques et les autres données observées devront être soigneusement évalués à cet effet.

56. Il est important, pour pouvoir accepter les données du bioessai utérotrophique, de considérer les poids utérins des animaux du groupe témoin qui a reçu le véhicule. Des valeurs témoins élevées peuvent compromettre la réactivité du bioessai et sa capacité de détection des agonistes des œstrogène de faible puissance. L'étude des données issues de la littérature et des données obtenues lors de la validation du bioessai utérotrophique semblent montrer que les moyennes de référence peuvent être élevées spontanément, en particulier chez les animaux immatures (2) (3) (6) (9). Le poids utérin des rates immatures dépend de nombreuses variables, notamment de la souche ou du poids corporel, c'est pourquoi aucune limite supérieure précise ne peut être indiquée pour le poids utérin. À titre indicatif, si le poids des utérus séchés des rates immatures du groupe témoin est compris entre 40 et 45 mg, les résultats peuvent être considérés comme suspects et des poids utérins supérieurs à 45 mg peuvent nécessiter de refaire l'essai. Il conviendra cependant de procéder à une évaluation au cas par cas (3) (6) (8). Dans l'essai sur des rates adultes, toute ovariectomie incomplète peut laisser des tissus ovariens susceptibles de produire des œstrogènes endogènes et de retarder la régression du poids utérin.

57. Pour les groupes témoins qui ont reçu le véhicule, l'obtention d'utérus séchés de poids inférieurs à 0,09 % du poids corporel pour les rates immatures et à 0,04 % pour les jeunes adultes ovariectomisées semble donner des résultats acceptables [voir tableau 31 (2)]. Si les poids utérins de référence sont supérieurs à ces valeurs, plusieurs facteurs doivent être vérifiés, notamment l'âge des animaux, la qualité de l'ovariectomie, les phytœstrogènes présents dans l'alimentation, et tout résultat négatif (pas d'indication d'activité œstrogénique) devra être considéré avec prudence.

58. Les données historiques concernant les groupes témoins qui ont reçu le véhicule doivent être conservées dans le laboratoire. Les données historiques concernant les effets des œstrogènes témoins positifs, tels que le 17α-éthinylestradiol, doivent aussi être conservées dans le laboratoire. Les laboratoires peuvent aussi tester les effets d'agonistes d'œstrogènes connus pour leur faible activité. Toutes ces données peuvent être comparées aux données dont on dispose (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) pour s'assurer que la sensibilité des méthodes du laboratoire est suffisante.

59. Lors de l'étude de validation de l'OCDE, la variabilité pondérale est apparue plus faible pour les utérus séchés que pour les utérus frais (6) (7). Toutefois, on considère qu'une réponse significative dans l'un ou l'autre cas indiquera que la substance d'essai est positive (activité œstrogénique).

60. La réponse utérotrophique n'est pas uniquement d'origine œstrogénique mais, s'il s'avère positif, le bioessai utérotrophique devra généralement être interprété comme preuve d'une activité œstrogénique potentielle in vivo, et devra normalement donner lieu à recherches plus poussées (voir le paragraphe 9 et le “Cadre conceptuel de l'OCDE pour les essais et l'évaluation des perturbateurs endocriniens”, appendice 2).

Figure 1

Schéma de l'ablation chirurgicale des ovaires

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