Décision d'exécution (UE) 2016/1840 de la Commission du 14 octobre 2016 modifiant l'annexe IV de la directive 2009/156/CE du Conseil en ce qui concerne les techniques de diagnostic de la peste équine [notifiée sous le numéro C(2016) 6509] (Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)

1.1.1.1.

1.1.1.2.

1.1.1.3.

1.1.1.4.

1.1.2.1.

Pour le titrage, réaliser des séries de dilution de 2 en 2 à partir du 1/25e (100 μl/puits), en utilisant une colonne de la plaque par sérum; réaliser la même opération avec les contrôles positif et négatif. Incuber pendant une heure à 37 °C.

1.1.2.2.

1.1.3.1.

1.1.3.2.

1.1.4.1.

Bloquer après environ cinq à dix minutes (avant que le contrôle négatif ne commence à se colorer) la réaction colorimétrique en ajoutant 50 μl de H2SO4 3N.

D'autres chromogènes tels que le ABTS (2,2′-azino-bis-[3-éthylbenzothiazoline-6-acide sulphonique), le TMB (tétraméthyle de benzidine) ou l'OPD (ortho-phényldiamine) peuvent aussi être utilisés.

1.1.4.2.

1.2.1.

1.2.2.

1.2.3.

1.2.4.

2.1.1.1.

2.1.1.2.

2.1.2.1.

Pour le titrage, réaliser une série de dilutions de 2 en 2 de sérums à tester de 1/10e à 1/280e à déposer dans huit puits (100 μl/puits), en utilisant une colonne de la plaque par sérum; réaliser la même opération avec les contrôles positif et négatif. Incuber pendant une heure à 37 °C.

2.1.2.2.

2.1.3.1.

2.1.3.2.

2.2.1.

2.2.2.

2.2.3.

2.2.4.

—

extraction au phénol-chloroforme des acides nucléiques,

—

adsorption des acides nucléiques sur la membrane filtrante,

—

adsorption des acides nucléiques sur un système de billes magnétiques.

1.1.

1 g d'échantillon de tissus est homogénéisé dans 1 ml de solution de dénaturation (4 M de thiocyanate de guanidinium, 25 mM de citrate de sodium, 0,1 M de 2-mercaptoéthanol, 0,5 % de Sarcosyl).

1.2.

Après centrifugation, 1 μg d'ARN de levure, 0,1 ml de 2 M d'acétate de sodium de pH 4, 1 ml de phénol et 0,2 ml d'un mélange de chloroforme et d'alcool isoamylique (au 49/1) sont ajoutés au surnageant.

1.3.

La suspension est agitée vigoureusement puis refroidie sur de la glace pendant 15 minutes.

1.4.

Après centrifugation, l'ARN présent dans la phase aqueuse est extrait au phénol, précipité à l'éthanol et remis en suspension dans de l'eau stérile.

—

amorce sens

5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′

—

amorce antisens

5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′

—

Sonde TaqMan MGB

5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′

2.1.1.

La concentration des stocks d'amorces est diluée à une concentration de travail de 8 μM (“stock de travail pour les amorces de 8 μM”), tandis que la sonde est diluée à une concentration de travail de 50 μM (“stock de travail pour la sonde de 50 μM”). Un plan de plaque d'essai devrait être conçu et chargé dans le logiciel de l'appareil de PCR en temps réel. En se servant du plan comme guide, 2,5 μl de chaque stock de travail pour les amorces de 8 μM sont ajoutés à chaque puits qui contiendra des échantillons d'ARN ainsi que des contrôles positifs et/ou négatifs (la concentration finale de l'amorce sera de 1 μM dans le mélange de la RT-PCR de 20 μl). La plaque est maintenue sur de la glace.

2.1.2.

2 μl d'ARN isolé (échantillons de test et contrôle positif), ou 2 μl d'eau exempte de RNase dans des contrôles à réaction négative sont mélangés avec des amorces sens et des amorces antisens. Ce mélange est dénaturé par un chauffage à 95 °C pendant 5 minutes, suivi d'un refroidissement rapide sur de la glace pendant au moins 5 minutes.

2.1.3.

Un volume du mélange réactionnel de la RT-PCR en temps réel en une étape adapté au nombre d'échantillons à tester est préparé en suivant les instructions du fabricant. 0,1 μl de stock de travail pour la sonde de 50 μM est ajouté à chaque puits contenant des échantillons d'ARN (la concentration finale de la sonde sera de 0,25 μM dans chaque puits contenant des échantillons d'ARN). 13 μl de mélange réactionnel de la RT-PCR en temps réel en une étape sont distribués dans chaque puits sur la plaque PCR contenant les amorces dénaturées et l'ARN.

2.1.4.

La plaque est placée dans un thermocycleur en temps réel programmé pour la transcription inverse et la détection de l'amplification/la fluorescence de l'ADNc. Les conditions d'amplification consistent en une première étape de transcription inverse de 25 minutes à 48 ƒC, puis d'une autre de 10 minutes à 95 °C (“démarrage à chaud”), et de 40 cycles de 15 secondes à 95 °C, 35 secondes à 55 °C et 30 secondes à 72 °C (ou 40 cycles à 97 °C pendant 2 secondes et 55 °C pendant 30 secondes si des réactifs et un thermocycleur permettant des réactions rapides sont utilisés). Les données de fluorescence sont acquises à la fin de l'étape à 55 °C.

2.1.5.

Le test est jugé non valide si les courbes d'amplification obtenues sont atypiques; il doit alors être répété.

Les échantillons sont considérés comme positifs si la valeur Ct (nombre de cycles pour que la fluorescence générée dans une réaction franchisse le seuil de fluorescence) est inférieure ou égale au seuil Ct défini (35) dans les 40 cycles de la PCR (Ct ≤ 35).

Les échantillons sont considérés comme non probants si la valeur Ct est supérieure au seuil Ct défini (35) dans les 40 cycles de la PCR (Ct ≥ 35).

Les échantillons sont considérés comme négatifs en cas d'obtention d'une courbe d'amplification horizontale qui ne franchit pas la ligne de seuil dans les 40 cycles de la PCR.

—

amorce sens

5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′

—

amorce antisens

5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′

—

Sonde TaqMan MGB

5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′

2.2.1.

Les solutions mères de mélange des amorces et de la sonde sont préparées dans une concentration 25 × à 5 μΜ pour les amorces sens et antisens et à 3 μΜ pour la sonde. Un plan de plaque d'essai devrait être conçu et chargé dans le logiciel de l'appareil PCR en temps réel. En se servant du plan comme guide, 5 μl d'échantillons d'ARN, comprenant des échantillons d'essai ainsi que les contrôles positif et négatif, sont ajoutés aux puits appropriés de la plaque suivant le plan.

2.2.2.

L'ARN est dénaturé par chauffage à 95 °C pendant 5 minutes, suivi d'un refroidissement rapide sur de la glace pendant au moins 3 minutes.

2.2.3.

Un volume du mélange réactionnel de la RT-PCR en temps réel en une étape adapté au nombre d'échantillons à tester est préparé en suivant les instructions du fabricant. 1 μl de solution mère de mélange des amorces et de la sonde 25 × (voir le point 2.2.1 ci-dessus) est incluse dans le mélange réactionnel afin d'obtenir une concentration finale dans chaque puits de 200 nM pour chaque amorce et de 120 nM pour la sonde. 20 μl du mélange réactionnel sont distribués dans chaque puits sur la plaque PCR contenant l'ARN dénaturé.

2.2.4.

La plaque est placée dans un thermocycleur en temps réel programmé pour la transcription inverse et la détection de l'amplification/la fluorescence de l'ADNc, conformément aux recommandations des fabricants. Les conditions d'amplification peuvent être les suivantes: une première étape de transcription inverse de 10 minutes à 48 °C, puis une autre de 10 minutes à 95 °C, et 40 cycles de 15 secondes à 95 °C et de 45 secondes à 60 °C.

2.2.5.

Les échantillons sont considérés comme positifs si la fluorescence normalisée pour l'épreuve RT-PCR pour le VPE dépasse un seuil de 0,1 dans les 36 cycles de la PCR dans tous les échantillons dupliqués.

Les échantillons sont considérés comme non concluants si la fluorescence normalisée pour l'épreuve RT-PCR pour le VPE dépasse un seuil de 0,1 entre 36 et 40 cycles de la PCR dans l'un des échantillons dupliqués.

Les échantillons sont considérés comme négatifs si la fluorescence normalisée pour l'épreuve RT-PCR pour le VPE ne dépasse pas un seuil de 0,1 dans les 40 cycles de la PCR dans tous les échantillons dupliqués et si la fluorescence normalisée pour le test de contrôle externe synthétique propriétaire dépasse un seuil de 0,1 dans les 33 cycles de la PCR.»