Règlement d’exécution (UE) 2024/771 de la Commission du 29 février 2024 modifiant le règlement (CE) no 152/2009 portant fixation des méthodes d’échantillonnage et d’analyse destinées au contrôle officiel des aliments pour animaux

«ANNEXE I

MÉTHODES D’ÉCHANTILLONNAGE

1. OBJET ET CHAMP D’APPLICATION

Les échantillons destinés au contrôle officiel des aliments pour animaux sont prélevés conformément aux modalités indiquées ci-après. Les échantillons ainsi obtenus sont considérés comme étant représentatifs des portions échantillonnées.

Le but de l’échantillonnage représentatif est d’obtenir une petite fraction d’un lot de façon que la détermination d’une caractéristique particulière de cette fraction représente la valeur moyenne de la caractéristique considérée pour l’ensemble du lot. Le lot est échantillonné par le prélèvement répété d’échantillons élémentaires en différents points du lot. Ces échantillons élémentaires sont combinés par mélange pour former un échantillon global dont sont tirés, par division représentative, des échantillons finals représentatifs.

Si un examen visuel ou un examen fondé sur d’autres informations pertinentes révèle que la qualité de certaines portions de l’aliment pour animaux devant être soumis à l’échantillonnage diffère de celle du reste du même lot, ces portions sont séparées du reste et traitées comme un sous-lot distinct. S’il n’est pas possible de le diviser en sous-lots distincts, l’aliment pour animaux est échantillonné en tant que lot unique. Dans de tels cas, il en est fait mention dans le rapport d’échantillonnage.

Lorsqu’il est constaté que des aliments pour animaux soumis à un échantillonnage conformément aux dispositions du présent règlement, et qui font partie d’un lot de la même catégorie ou correspondant à la même description, ne satisfont pas aux exigences de l’Union européenne, il est présumé que la totalité des aliments de ce lot est défectueuse, sauf si une évaluation détaillée n’a pas fourni d’éléments indiquant que le reste du lot ne répond pas aux exigences de l’Union européenne.

L’échantillonnage peut aussi porter sur les aliments pour animaux mis en vente par les exploitants du secteur de l’alimentation animale au moyen d’une technique de communication à distance conformément à l’article 11, paragraphe 3, du règlement (CE) no 767/2009 du Parlement européen et du Conseil (1). Le prélèvement d’échantillons d’aliments pour animaux mis en vente au moyen d’une technique de communication à distance est en principe soumis aux dispositions de la présente annexe. Le point 11 règle les aspects spécifiques du prélèvement d’échantillons de marchandises vendues à distance.

2. DÉFINITIONS

—

Lot: quantité identifiée d’aliment pour animaux dont il est établi qu’elle présente des caractéristiques communes, telles que l’origine, la variété, le type d’emballage, l’emballeur, l’expéditeur ou l’étiquetage, et, dans le cas d’un processus de production, une quantité de produit fabriquée dans une seule usine en utilisant des paramètres de production uniformes ou plusieurs de ces quantités lorsqu’elles sont produites en ordre continu et entreposées ensemble.

—	Portion échantillonnée: lot ou partie identifiée du lot ou du sous-lot.

—	Échantillon scellé: échantillon scellé de manière à ce qu’il soit impossible d’accéder à l’échantillon sans briser ou retirer le scellé.

—	Échantillon élémentaire: quantité prélevée en un point de la portion échantillonnée.

—	Échantillon global: ensemble d’échantillons élémentaires prélevés sur la même portion échantillonnée.

—	Échantillon réduit: partie de l’échantillon global, obtenue par réduction représentative de celui-ci.

—	Échantillon final: partie de l’échantillon global (mélangé), de l’échantillon réduit ou de l’échantillon global homogénéisé, selon le type de contrôle (voir le point 9.4).

—	Échantillon de laboratoire: échantillon destiné au laboratoire (tel que reçu par le laboratoire) qui peut être l’échantillon final, l’échantillon réduit ou l’échantillon global.

—	Échantillon de marchandises vendues à distance: échantillon d’un lot d’aliments pour animaux mis en vente au moyen d’une technique de communication à distance.

3. DISPOSITIONS GÉNÉRALES

—	Les échantillons sont prélevés par des personnes habilitées à cet effet par l’autorité compétente.

—	Pour un échantillon de marchandises vendues à distance, l’autorité compétente demande une quantité d’aliments pour animaux à l’exploitant du secteur de l’alimentation animale au moyen d’une technique de communication à distance.

—	L’échantillon doit être scellé de sorte qu’il soit impossible d’y accéder sans briser ou retirer le scellé.

La marque du scellé doit être clairement identifiable et visible.

—	Identification de l’échantillon: l’échantillon doit être pourvu d’une marque indélébile et être identifié de façon à établir un lien non équivoque avec le rapport d’échantillonnage.

—

Les échantillons finals suivants sont prélevés sur chaque échantillon global ou échantillon réduit: un échantillon est prélevé à des fins de contrôle (surveillance du respect de la loi) et un autre est prélevé à l’intention de l’exploitant du secteur de l’alimentation animale (à des fins de recours). Enfin, un autre échantillon final peut être prélevé à des fins de référence. Si l’échantillon global complet est homogénéisé, les échantillons finals sont prélevés sur celui-ci, à moins que cette procédure ne soit contraire à la législation des États membres concernant le droit des exploitants du secteur de l’alimentation animale.

—

Conformément à l’article 15, paragraphes 1 et 2, du règlement (UE) 2017/625, dans la mesure où c’est nécessaire à la réalisation des échantillonnages officiels, les exploitants du secteur de l’alimentation animale doivent, lorsque les autorités compétentes l’exigent: — autoriser l’accès du personnel des autorités compétentes aux équipements sous leur contrôle, y compris, si nécessaire, en mettant à sa disposition l’équipement d’échantillonnage et de protection individuelle adapté, — aider le personnel des autorités compétentes et coopérer avec lui afin de permettre le prélèvement d’échantillons, y compris en lui donnant accès aux aliments pour animaux.

4. APPAREILLAGE

4.1. Les appareils destinés aux prélèvements doivent être construits en matériaux qui ne contaminent pas les produits à prélever. Les appareils destinés à être utilisés à plusieurs reprises doivent être faciles à nettoyer pour éviter toute contamination croisée.

4.2. Appareils recommandés pour le prélèvement d’échantillons d’aliments pour animaux solides

4.2.1. Prélèvement manuel

4.2.1.1.

Pelle à fond plat et à bords verticaux.

4.2.1.2.

Sonde à fente longue ou compartimentée. Les dimensions de la sonde doivent être adaptées aux caractéristiques de la portion échantillonnée (profondeur du récipient, dimensions du sac, etc.) et à la taille des particules composant l’aliment. Si la sonde présente plusieurs orifices, ces derniers doivent être séparés par des compartiments ou répartis de façon séquentielle afin de garantir que l’échantillon est prélevé en divers points autour de la sonde.

4.2.2. Prélèvement mécanique

Des appareils mécaniques appropriés peuvent être utilisés pour prélever des échantillons d’aliments en mouvement. Les appareils mécaniques sont réputés appropriés lorsqu’ils permettent de prélever au moins une section complète du flot.

Le prélèvement d’aliments pour animaux en mouvement (à des débits élevés) peut être effectué au moyen d’échantillonneurs automatiques.

4.2.3. Diviseur

Le cas échéant, des appareils destinés à diviser l’échantillon en parts approximativement égales devraient être utilisés pour la préparation d’échantillons réduits représentatifs.

5. EXIGENCES QUANTITATIVES CONCERNANT LE NOMBRE D’ÉCHANTILLONS ÉLÉMENTAIRES

—

Les exigences quantitatives relatives au nombre d’échantillons élémentaires figurant aux points 5.1 et 5.2 s’appliquent à des portions échantillonnées n’excédant pas 500 tonnes et qui peuvent faire l’objet d’un échantillonnage représentatif. La procédure d’échantillonnage décrite est aussi valable pour des quantités supérieures à la taille maximale prescrite pour la portion échantillonnée, à condition de ne pas tenir compte du nombre maximal d’échantillons élémentaires indiqué dans les tableaux figurant ci-après au points 5.1.1, 5.1.3 et 5.1.5 — le nombre d’échantillons élémentaires étant déterminé grâce à la formule mathématique indiquée dans la partie pertinente de la procédure (voir le point 5.3) — et d’augmenter proportionnellement la taille minimale de l’échantillon global. Il est néanmoins possible de diviser un lot de grande taille en sous-lots plus petits et d’échantillonner chaque sous-lot conformément à la procédure décrite aux points 5.1 et 5.2.

—	La taille de la portion échantillonnée doit être telle que toutes les parties qui la composent puissent être échantillonnées.

—

Pour les lots ou sous-lots de très grande taille (> 500 tonnes) et les lots qui sont transportés ou stockés d’une manière qui ne permet pas d’effectuer l’échantillonnage conformément à la procédure prévue aux points 5.1 et 5.2 du présent point, la procédure d’échantillonnage prévue au point 5.3 doit être appliquée.

—

Pour les échantillons de marchandises vendues à distance, la taille du lot dont une quantité est demandée est généralement inconnue de l’autorité compétente. Par conséquent, la procédure visée aux points 5.1 et 5.2 ne peut être utilisée. En pareil cas, la procédure décrite au point 11 est appliquée.

—

Si la législation impose à l’exploitant du secteur de l’alimentation animale de se conformer au présent règlement dans le cadre d’un système de contrôle obligatoire, l’exploitant peut s’écarter des exigences quantitatives prévues au présent point afin de tenir compte de caractéristiques opérationnelles, à la condition qu’il ait démontré, à la satisfaction de l’autorité compétente, l’équivalence de la procédure d’échantillonnage du point de vue de la représentativité, et après avoir obtenu l’autorisation de l’autorité compétente.

—

Dans des cas exceptionnels, s’il n’est pas possible d’appliquer la méthode d’échantillonnage décrite en ce qui concerne les exigences quantitatives, parce qu’elle entraînerait une dégradation inacceptable de la valeur commerciale du lot (à cause des formes d’emballage, des moyens de transport, du mode de stockage, etc.), un autre mode de prélèvement peut être appliqué, à condition qu’il soit aussi représentatif que possible et qu’il soit décrit en détail et bien documenté.

5.1. Exigences quantitatives concernant les échantillons élémentaires en rapport avec le contrôle des substances ou produits répartis uniformément dans les aliments pour animaux

5.1.1. Aliments solides en vrac

Taille de la portion échantillonnée	Nombre minimal d’échantillons élémentaires
≤ 2,5 tonnes	7
> 2,5 tonnes	√ (20 fois le nombre de tonnes constituant la portion échantillonnée) (*1), jusqu’à 40 échantillons élémentaires

5.1.2. Aliments liquides en vrac

Taille de la portion échantillonnée	Nombre minimal d’échantillons élémentaires
≤ 2,5 tonnes ou ≤ 2 500 litres	4 (*2)
> 2,5 tonnes ou > 2 500 litres	7 (*2)

5.1.3. Aliments emballés

Les aliments pour animaux (solides et liquides) peuvent être emballés dans des sachets, des sacs, des boîtes, des barils, etc., qui sont désignés comme des unités dans le tableau ci-après. Les unités de grande taille (≥ 500 kg ou litres) doivent être échantillonnées conformément aux dispositions prévues pour les aliments pour animaux en vrac (voir les points 5.1.1 et 5.1.2).

Taille de la portion échantillonnée	Nombre minimal d’unités sur lesquelles (au moins) un échantillon élémentaire doit être prélevé (*3)
De 1 à 20 unités	1 unité (*4)
De 21 à 150 unités	3 unités (*4)
De 151 à 400 unités	5 unités (*4)
> 400 unités	¼ du √ (nombre d’unités constituant la portion échantillonnée) (*5), jusqu’à 40 unités

5.1.4. Aliments en briques et pierres à lécher

Au minimum une brique ou pierre à prélever par portion échantillonnée de 25 unités, jusqu’à quatre briques ou pierres au maximum.

Pour les briques ou pierres à lécher dont le poids unitaire n’excède pas 1 kg, une brique ou une pierre constituent un échantillon élémentaire.

5.1.5. Fourrages grossiers/fourrage

Taille de la portion échantillonnée	Nombre minimal d’échantillons élémentaires (*6)
≤ 5 tonnes	5
> 5 tonnes	√ (5 fois le nombre de tonnes constituant la portion échantillonnée) (*7), jusqu’à 40 échantillons élémentaires

5.2. Exigences quantitatives concernant les échantillons élémentaires en rapport avec le contrôle des constituants ou substances susceptibles d’être répartis non uniformément dans les aliments pour animaux

Ces exigences quantitatives concernant les échantillons élémentaires s’appliquent dans les situations suivantes:

—	contrôle de la présence d’aflatoxines, d’ergot de seigle, d’autres mycotoxines et impuretés botaniques nuisibles dans les matières premières des aliments pour animaux,

—	contrôle de la contamination croisée par un constituant, y compris le matériel génétiquement modifié, ou une substance susceptibles d’être répartis non uniformément dans les aliments pour animaux.

Si l’autorité de contrôle suspecte fortement qu’une telle répartition non uniforme existe également dans le cas d’une contamination croisée par un constituant ou une substance dans un aliment composé pour animaux, les exigences quantitatives figurant dans le tableau ci-après peuvent être appliquées.

Taille de la portion échantillonnée	Nombre minimal d’échantillons élémentaires
< 80 tonnes	Voir les exigences quantitatives au point 5.1. Le nombre d’échantillons élémentaires à prélever doit être multiplié par 2,5.
≥ 80 tonnes	100

5.3. Exigences quantitatives concernant les échantillons élémentaires dans les cas de lots de très grande taille

Dans le cas de portions échantillonnées de grande taille (> 500 tonnes), le nombre d’échantillons élémentaires à prélever = 40 échantillons élémentaires + √ tonnes pour le contrôle des substances ou produits répartis uniformément dans les aliments pour animaux, ou 100 échantillons élémentaires + √ tonnes pour le contrôle des constituants ou substances susceptibles d’être répartis non uniformément dans les aliments pour animaux.

6. EXIGENCES QUANTITATIVES CONCERNANT LES ÉCHANTILLONS GLOBAUX

Un seul échantillon global par portion échantillonnée est requis.

	Nature des aliments pour animaux	Taille minimale de l’échantillon global (*8) (*9)
6.1.	Aliments en vrac	4 kg
6.2.	Aliments emballés	4 kg (*10)
6.3.	Aliments liquides ou semi-liquides	4 litres
6.4.	Aliments en briques ou pierres à lécher:
6.4.1.	d’un poids unitaire excédant 1 kg	4 kg
6.4.2.	d’un poids unitaire n’excédant pas 1 kg	poids de quatre briques ou pierres d’origine
6.5.	Fourrage grossier/fourrage	4 kg (*11)

7. EXIGENCES QUANTITATIVES CONCERNANT LES ÉCHANTILLONS FINALS

Échantillons finals

L’analyse d’au moins un échantillon final est requise. La quantité de l’échantillon final destinée à l’analyse ne peut être inférieure aux valeurs suivantes:

Aliments solides	500 g (*) (*12) (*13) (*14) (*15)
Aliments liquides ou semi-liquides	500 ml (*12)

8. MÉTHODE D’ÉCHANTILLONNAGE POUR LES LOTS DE TRÈS GRANDE TAILLE OU LES LOTS STOCKÉS OU TRANSPORTÉS DE TELLE MANIÈRE QU’UN ÉCHANTILLONNAGE DANS L’ENSEMBLE DU LOT N’EST PAS POSSIBLE

8.1. Principes généraux

Si le mode de transport ou de stockage d’un lot ne permet pas de prélever des échantillons élémentaires dans l’ensemble du lot, l’échantillonnage doit de préférence être effectué lorsque ce lot est en mouvement.

Dans le cas des grands entrepôts destinés au stockage d’aliments pour animaux, il convient d’encourager les opérateurs à installer dans l’entrepôt des équipements permettant de prélever (automatiquement) des échantillons dans l’ensemble du lot stocké.

Si les procédures d’échantillonnage prévues au présent point sont appliquées, l’exploitant du secteur de l’alimentation animale ou son représentant en sont informés. Si l’exploitant du secteur de l’alimentation animale ou son représentant remettent en cause la procédure d’échantillonnage, ils permettent à l’autorité compétente de prélever des échantillons dans l’ensemble du lot aux frais de l’exploitant.

8.2. Lots de grande taille transportés par bateau

8.2.1. Échantillonnage dynamique de lots de grande taille transportés par bateau

L’échantillonnage de lots de grande taille transportés par bateau est effectué de préférence lorsque le produit est en mouvement (échantillonnage dynamique).

L’échantillonnage doit être fait par cale (entité qui peut être physiquement séparée). Cependant, les cales sont vidées partiellement l’une après l’autre, de sorte que la séparation physique initiale n’existe plus après le transfert dans les installations de stockage. L’échantillonnage peut donc être réalisé en fonction de la séparation physique initiale ou en fonction de la séparation après transfert dans les installations de stockage.

Le déchargement d’un bateau peut durer plusieurs jours. Normalement, l’échantillonnage doit être effectué à intervalles réguliers tout au long du déchargement. Toutefois, la présence d’un inspecteur officiel chargé de l’échantillonnage pendant toute l’opération de déchargement n’est pas toujours possible ou appropriée. Par conséquent, la réalisation d’un échantillonnage sur une partie (portion échantillonnée) du lot est autorisée. Le nombre d’échantillons élémentaires est déterminé en tenant compte de la taille de la portion échantillonnée.

Si l’échantillonnage d’une partie d’un lot d’aliments pour animaux de la même catégorie ou correspondant à la même description révèle que cette partie du lot ne satisfait pas aux exigences de l’Union européenne, il est présumé que la totalité des aliments de ce lot est défectueuse, sauf si une évaluation détaillée n’a pas fourni d’éléments indiquant que le reste du lot ne répond pas aux exigences de l’Union européenne.

Même si l’échantillon officiel est prélevé automatiquement, la présence d’un inspecteur est nécessaire. Cependant, si l’échantillonnage automatique est effectué selon des paramètres préétablis qui ne peuvent être modifiés durant l’échantillonnage et si les échantillons élémentaires sont collectés dans un réceptacle scellé prévenant toute fraude, la présence d’un inspecteur n’est requise qu’au début de l’échantillonnage, chaque fois que le réceptacle contenant les échantillons doit être changé, ainsi qu’à la fin de l’échantillonnage.

8.2.2. Échantillonnage statique de lots transportés par bateau

Si l’échantillonnage est effectué de façon statique, la procédure prévue pour les installations de stockage (silos) accessibles par le haut doit être appliquée (voir le point 8.4.1).

L’échantillonnage doit être effectué sur la partie accessible (par le haut) du lot/de la cale. Le nombre d’échantillons élémentaires est déterminé en tenant compte de la taille de la portion échantillonnée. Si l’échantillonnage d’une partie d’un lot d’aliments pour animaux de la même catégorie ou correspondant à la même description révèle que cette partie du lot ne satisfait pas aux exigences de l’Union européenne, il est présumé que la totalité des aliments de ce lot est défectueuse, sauf si une évaluation détaillée n’a pas fourni d’éléments indiquant que le reste du lot ne répond pas aux exigences de l’Union européenne.

8.3. Échantillonnage de lots de grande taille stockés dans des entrepôts

L’échantillonnage doit être effectué sur la partie accessible du lot. Le nombre d’échantillons élémentaires est déterminé en tenant compte de la taille de la portion échantillonnée. Si l’échantillonnage d’une partie d’un lot d’aliments pour animaux de la même catégorie ou correspondant à la même description révèle que cette partie du lot ne satisfait pas aux exigences de l’Union européenne, il est présumé que la totalité des aliments de ce lot est défectueuse, sauf si une évaluation détaillée n’a pas fourni d’éléments indiquant que le reste du lot ne répond pas aux exigences de l’Union européenne.

8.4. Échantillonnage dans des installations de stockage (silos)

8.4.1. Échantillonnage dans des silos (facilement) accessibles par le haut

L’échantillonnage doit être effectué sur la partie accessible du lot. Le nombre d’échantillons élémentaires est déterminé en tenant compte de la taille de la portion échantillonnée. Si l’échantillonnage d’une partie d’un lot d’aliments pour animaux de la même catégorie ou correspondant à la même description révèle que cette partie du lot ne satisfait pas aux exigences de l’Union européenne, il est présumé que la totalité des aliments de ce lot est défectueuse, sauf si une évaluation détaillée n’a pas fourni d’éléments indiquant que le reste du lot ne répond pas aux exigences de l’Union européenne.

8.4.2. Échantillonnage dans des silos inaccessibles par le haut (silos fermés)

8.4.2.1. Silos inaccessibles par le haut (silos fermés) d’une capacité supérieure à 100 tonnes

Les aliments pour animaux entreposés dans des silos de ce type ne peuvent faire l’objet d’un échantillonnage statique. Par conséquent, si les aliments pour animaux entreposés dans le silo doivent faire l’objet d’un échantillonnage et s’il n’est pas possible de déplacer le lot, il doit être convenu avec l’opérateur qu’il informe l’inspecteur du moment où le silo sera déchargé afin de permettre l’échantillonnage des aliments en mouvement.

8.4.2.2. Silos inaccessibles par le haut (silos fermés) d’une capacité inférieure à 100 tonnes

La procédure d’échantillonnage consiste à transférer dans un réceptacle une quantité comprise entre 50 et 100 kg et à y prélever l’échantillon. La taille de l’échantillon global correspond au lot entier et le nombre d’échantillons élémentaires dépend de la quantité transférée du silo vers le réceptacle en vue de l’échantillonnage. Si l’échantillonnage d’une partie d’un lot d’aliments pour animaux de la même catégorie ou correspondant à la même description révèle que cette partie du lot ne satisfait pas aux exigences de l’Union européenne, il est présumé que la totalité des aliments de ce lot est défectueuse, sauf si une évaluation détaillée n’a pas fourni d’éléments indiquant que le reste du lot ne répond pas aux exigences de l’Union européenne.

8.5. Échantillonnage d’aliments pour animaux en vrac dans des conteneurs fermés de grande taille

Il est fréquent que de tels lots ne puissent faire l’objet d’un échantillonnage que quand ils sont déchargés. Dans certains cas, il est impossible de décharger ce type de conteneurs au point d’importation ou de contrôle; c’est pourquoi l’échantillonnage devrait avoir lieu lorsqu’ils sont déchargés.

9. INSTRUCTIONS CONCERNANT LE PRÉLÈVEMENT, LA PRÉPARATION ET LE CONDITIONNEMENT DES ÉCHANTILLONS

9.1. Généralités

Prélever et préparer les échantillons sans délai indu en tenant compte des précautions requises pour éviter que le produit ne soit altéré ou contaminé. Les instruments, les surfaces et les récipients destinés à recevoir les échantillons doivent être propres et secs.

9.2. Échantillons élémentaires

Les échantillons élémentaires doivent être prélevés au hasard et uniformément répartis dans l’ensemble de la portion échantillonnée et être approximativement égaux en poids.

La taille minimale de l’échantillon élémentaire est de 100 g ou de 25 g dans le cas de fourrage grossier ou de fourrage de faible densité relative.

Si, conformément aux règles de la procédure d’échantillonnage établie au point 8, moins de 40 échantillons élémentaires doivent être prélevés, la taille des échantillons élémentaires doit être déterminée en fonction de la taille requise pour l’échantillon global à constituer (voir le point 6).

En cas d’échantillonnage de petits lots d’aliments pour animaux emballés sur lesquels, conformément aux exigences quantitatives, un nombre limité d’échantillons élémentaires doit être prélevé, le contenu d’une unité d’origine n’excédant pas 1 kg ou 1 litre constitue un échantillon élémentaire.

En cas d’échantillonnage d’aliments pour animaux emballés composés de petites unités (par exemple < 250 g), la taille de l’échantillon élémentaire dépend de la taille de l’unité.

En cas d’échantillonnage de marchandises vendues à distance, la taille de l’échantillon élémentaire dépend de la taille de l’unité et peut également être inférieure à 100 g ou 100 ml dans certains cas.

9.2.1. Aliments en vrac

Selon le cas, l’échantillonnage peut avoir lieu lors de la mise en mouvement de la portion échantillonnée (chargement ou déchargement).

9.2.2. Aliments emballés

Le nombre requis d’unités à échantillonner étant délimité comme indiqué au point 5, prélever une partie du contenu de chaque unité au moyen d’une sonde ou d’une pelle. Si nécessaire, prélever les échantillons après avoir vidé séparément les unités.

9.2.3. Aliments liquides ou semi-liquides homogènes ou homogénéisables

Le nombre requis d’unités à échantillonner étant délimité comme indiqué au point 5, effectuer un prélèvement dans chaque unité après en avoir homogénéisé le contenu, si nécessaire.

Les échantillons élémentaires peuvent être prélevés lors du soutirage du contenu.

9.2.4. Aliments liquides ou semi-liquides non homogénéisables

Le nombre requis d’unités à échantillonner étant délimité comme indiqué au point 5, prélever les échantillons à différents niveaux.

Les échantillons peuvent également être prélevés lors du soutirage du contenu, après élimination des premières fractions.

Dans les deux cas, le volume total prélevé ne peut être inférieur à 10 litres.

9.2.5. Aliments en briques et pierres à lécher

Le nombre requis de briques ou de pierres à échantillonner étant délimité comme indiqué au point 5, une partie de chaque brique ou pierre peut être prélevée. En cas de suspicion de non-homogénéité d’une brique ou d’une pierre, l’intégralité de cette dernière peut faire office d’échantillon.

Pour les briques ou pierres à lécher dont le poids unitaire n’excède pas 1 kg, une brique ou une pierre constituent un échantillon élémentaire.

9.3. Préparation des échantillons globaux

Mélanger les échantillons élémentaires pour constituer un seul échantillon global.

9.4. Préparation des échantillons finals

Mélanger soigneusement l’échantillon global (2).

Introduire chaque échantillon dans un récipient/réceptacle approprié. Prendre toutes les précautions nécessaires pour éviter toute modification de la composition de l’échantillon ou toute contamination ou altération pouvant survenir au cours du transport ou du stockage.

9.4.1. Substances réparties uniformément

Pour le contrôle des constituants ou substances répartis uniformément dans les aliments pour animaux, l’échantillon global peut être réduit de façon représentative à 2,0 kg ou 2,0 litres au moins (échantillon réduit) (3), de préférence au moyen d’un diviseur mécanique ou automatique. Pour le contrôle de la présence de résidus de pesticides dans les légumineuses, les grains de céréales et les fruits à coque, la taille minimale de l’échantillon réduit est de 3 kg. Si la nature des aliments pour animaux ne permet pas d’utiliser un diviseur ou si ce dernier n’est pas disponible, l’échantillon peut être réduit par la méthode des quartiers.

À partir de l’échantillon global ou des échantillons réduits, prélever des échantillons finals (à des fins de contrôle, de recours et éventuellement de référence) de quantité approximativement égale et conformes aux exigences quantitatives figurant au point 7.

9.4.2. Substances réparties non uniformément

En cas de contrôle des constituants, y compris le matériel génétiquement modifié, ou substances susceptibles d’être répartis non uniformément dans les aliments pour animaux, l’échantillon global est:

i)	complètement homogénéisé. Ensuite, à partir de l’échantillon global homogénéisé, prélever des échantillons finals (à des fins de contrôle, de recours et éventuellement de référence) de quantité approximativement égale et conformes aux exigences quantitatives figurant au point 7; ou

ii)

réduit à 2 kg ou 2 litres au moins (4) au moyen d’un diviseur mécanique ou automatique. Si la nature des aliments pour animaux ne permet pas d’utiliser un diviseur, et dans ce cas uniquement, l’échantillon peut, si nécessaire, être réduit par la méthode des quartiers. Pour le contrôle de la présence de matériel génétiquement modifié dans le cadre du règlement (UE) no 619/2011, l’échantillon réduit doit contenir au moins 35 000 graines/semences pour permettre d’obtenir des échantillons finals à des fins de contrôle, de recours et éventuellement de référence comportant au moins 10 000 graines/semences [voir la note de bas de page (**) au point 6 et la note de bas de page (*) au point 7].

À partir des échantillons réduits, prélever des échantillons finals de quantité approximativement égale et conformes aux exigences quantitatives figurant au point 7.

9.5. Conditionnement des échantillons

Sceller et étiqueter les récipients ou emballages de façon à ce qu’il soit impossible de les ouvrir sans briser le scellé. L’étiquette générale doit être incorporée dans le scellé. L’échantillon peut également être placé dans un récipient pouvant être fermé de manière à ce qu’il soit impossible de l’ouvrir sans endommager irréversiblement le réceptacle ou le contenant, afin d’éviter sa réutilisation.

9.6. Envoi des échantillons au laboratoire

Transmettre l’échantillon sans délai indu au laboratoire d’analyse désigné, avec les indications nécessaires à l’analyse.

10. PROCÈS-VERBAL D’ÉCHANTILLONNAGE

Pour chaque échantillon, établir un procès-verbal d’échantillonnage permettant d’identifier sans ambiguïté la portion échantillonnée et sa taille.

Mentionner également dans le procès-verbal tout écart par rapport à la procédure d’échantillonnage prévue par le présent règlement.

Mettre le procès-verbal à la disposition du laboratoire de contrôle officiel ainsi que de l’exploitant du secteur de l’alimentation animale et/ou du laboratoire désigné par ce dernier.

11. ÉCHANTILLON DE MARCHANDISES VENDUES À DISTANCE

—

Pour un échantillon de marchandises vendues à distance, demander les aliments pour animaux à l’exploitant du secteur de l’alimentation animale au moyen d’une technique de communication à distance. Dans ce cas, lorsqu’elle demande des aliments pour animaux, l’autorité compétente ne doit pas décliner son identité officielle à l’exploitant du secteur de l’alimentation animale et peut utiliser une identité d’emprunt.

—

L’échantillon global et les échantillons finals de l’échantillon de marchandises vendues à distance doivent être prélevés dès réception de l’envoi par les personnes habilitées à cet effet. Pour former l’échantillon global, un nombre adéquat d’échantillons élémentaires doit être prélevé au hasard et uniformément réparti dans la quantité totale obtenue et soigneusement mélangée/homogénéisée, conformément, dans la mesure du possible, aux principes énoncés au point 5 et aux points 9.2 et 9.3. Si les aliments pour animaux sont emballés dans des unités individuelles, au moins 4 unités doivent être obtenues desquelles au moins un échantillon élémentaire doit être prélevé. S’il devait être constaté, au cas par cas, que les unités obtenues proviennent de lots différents, les échantillons devraient être prélevés dans un nombre d’unités réduites correspondant aux unités provenant du même lot. Lorsque l’analyse de l’échantillon de marchandises vendues à distance concerne la recherche de constituants ou de substances qui ne sont pas répartis uniformément dans les aliments pour animaux, le nombre d’échantillons élémentaires doit être au moins 2,5 fois supérieur à celui des échantillons analysés pour des substances uniformément répartie dans les aliments pour animaux. Les échantillons finals correspondants sont alors prélevés (à des fins de contrôle, de recours et éventuellement de référence) sur l’échantillon global conformément, dans la mesure du possible, aux principes énoncés au point 9.4 et le procès-verbal d’échantillonnage indique que l’échantillon est un échantillon de marchandises vendues à distance. L’autorité compétente informe alors immédiatement l’exploitant du secteur de l’alimentation animale de l’échantillonnage. L’exploitant du secteur de l’alimentation animale est aussi informé qu’un échantillon est tenu, quand c’est possible, à sa disposition par l’autorité compétente dans un endroit spécifié à des fins de recours ou qu’il est envoyé à l’exploitant du secteur de l’alimentation animale ou au laboratoire désigné par l’exploitant du secteur de l’alimentation animale conformément aux règles nationales en vigueur. Si l’échantillon est envoyé directement au laboratoire officiel, l’échantillon final doit être préparé et scellé au laboratoire par des personnes habilitées à cet effet ou en présence de personnes habilitées à cet effet. Le procès-verbal d’échantillonnage de l’échantillon de marchandises vendues à distance doit être envoyé immédiatement après la formation des échantillons finals à l’autorité compétente, qui informe l’exploitant du secteur de l’alimentation animale de l’échantillonnage. On estime que la quantité fournie par l’exploitant du secteur de l’alimentation animale à l’autorité compétente représente une partie d’un lot d’aliments pour animaux de la même catégorie ou correspondant à la même description. Conformément à l’article 15 du règlement (CE) no 178/2002 du Parlement européen et du Conseil (5), si cette partie du lot est identifiée comme ne satisfaisant pas aux prescriptions de l’Union européenne, il est présumé, dans le cas d’un échantillon de marchandises vendues à distance aussi, que la totalité des aliments pour animaux de ce lot est défectueuse, sauf si une évaluation détaillée montre qu’il n’y a pas de preuve que le reste du lot ne satisfait pas aux exigences de l’Union européenne.

«ANNEXE II

DISPOSITIONS GÉNÉRALES CONCERNANT LES MÉTHODES D’ANALYSE DES ALIMENTS POUR ANIMAUX

A. PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS EN VUE DE L’ANALYSE

1. Objet

Les procédures décrites dans la présente annexe portent sur la préparation, en vue de leur analyse, des échantillons envoyés aux laboratoires de contrôle après leur prélèvement conformément aux dispositions de l’annexe I.

La préparation des échantillons de laboratoire doit permettre que les prises d’essais prévues dans les méthodes d’analyse soient homogènes et représentatives des échantillons finals.

Outre les procédures décrites dans la présente annexe, les lignes directrices pour la préparation des échantillons établies par la norme EN ISO 6498 doivent être suivies.

2. Précautions à prendre

La procédure à suivre pour préparer des échantillons dépend des méthodes d’analyse à appliquer et des constituants ou substances à contrôler. Il est donc essentiel que la procédure suivie en la matière soit adaptée à la méthode d’analyse appliquée ainsi qu’aux constituants ou substances à contrôler.

Effectuer toutes les opérations de façon à éviter autant que possible une contamination de l’échantillon ou des modifications de sa composition.

Effectuer les broyages, les mélanges et les tamisages sans délai, en exposant au minimum l’échantillon à l’air et à la lumière. Éviter l’utilisation de moulins ou de broyeurs susceptibles de produire un échauffement notable de l’échantillon.

Le broyage manuel est recommandé pour les aliments particulièrement sensibles à la chaleur. Veiller, en outre, à ce que l’appareillage même ne soit pas une source de contamination.

Homogénéiser l’échantillon en le mélangeant à de l’eau pour en faire une pâte au moyen d’un broyeur à fort taux de cisaillement permet dans certains cas d’obtenir des sous-échantillons plus homogènes que l’homogénéisation ou le broyage à sec, en particulier pour les substances chimiques réparties de manière hétérogène. Néanmoins, l’homogénéisation par broyage à sec suffisant peut aussi donner des sous-échantillons homogènes.

Dans certains cas, comme pour le dosage de l’ergot de seigle, d’impuretés botaniques nuisibles, etc., l’échantillon ne peut être homogénéisé par broyage, mais par un mélange suffisant.

Si la préparation entraîne inévitablement une modification significative de la teneur en humidité de l’échantillon, déterminer sa teneur en humidité avant et après la préparation selon la méthode prévue au point A de l’annexe III.

3. Mode opératoire

3.1. Procédure générale

L’aliquote de test est prélevée sur l’échantillon homogénéisé final. La méthode des quartiers opposés n’est pas recommandée, car elle peut aboutir à des aliquotes de test présentant une erreur de division élevée.

3.1.1. Aliments pouvant être moulus en l’état

—	Mélanger l’échantillon final et le recueillir dans un récipient approprié, propre et sec, muni d’une fermeture hermétique. Mélanger de nouveau pour garantir une homogénéisation complète, immédiatement avant de prélever la prise d’essai (aliquote de test).

3.1.2. Aliments pouvant être moulus après dessiccation

—

Sauf indication spécifique dans les méthodes d’analyse, dessécher l’échantillon, de façon à ramener sa teneur en humidité à un niveau compris entre 8 et 12 %, en appliquant le procédé de prédessiccation décrit au point 4.3 de la méthode de dosage de l’humidité mentionnée au point A de l’annexe III. Procéder ensuite comme indiqué au point 3.1.1.

3.1.3. Aliments liquides ou semi-liquides

—	Recueillir l’échantillon final dans un récipient approprié, propre et sec, muni d’une fermeture hermétique. Mélanger soigneusement pour garantir une homogénéisation complète, immédiatement avant de prélever la prise d’essai (aliquote de test).

3.1.4. Autres aliments

—	Si l’échantillon final ne peut être préparé selon l’un des procédés indiqués ci-dessus, appliquer tout autre procédé de préparation approprié permettant d’obtenir des prises d’essai (aliquotes de test) homogènes et représentatives des échantillons finals.

3.2. Procédure spécifique en cas d’examen visuel ou microscopique ou dans les cas où l’échantillon global est entièrement homogénéisé

—	En cas d’examen visuel (sans microscope), l’échantillon global ou final est examiné dans son intégralité.

—

En cas d’examen au microscope, le laboratoire peut réduire l’échantillon global ou réduire encore davantage l’échantillon réduit. Les échantillons finals destinés à des fins de recours et, éventuellement, à des fins de référence sont prélevés selon une procédure équivalente à la procédure appliquée pour prélever l’échantillon final destiné à des fins de contrôle.

—	Si l’échantillon global est entièrement homogénéisé, les échantillons finals sont prélevés sur l’échantillon global homogénéisé.

—

Pour le dosage de l’ergot de seigle et des impuretés botaniques nuisibles, l’échantillon final doit être divisé en deux sous-échantillons d’un poids égal approximatif de 500 grammes. Un sous-échantillon est examiné. Si le résultat des sous-échantillons est inférieur ou égal à 50 % (seuil analytique) de la teneur maximale, l’échantillon est conforme à la teneur maximale. Si le résultat est supérieur à 50 % de la teneur maximale, un autre sous-échantillon doit être examiné et la moyenne des résultats des deux sous-échantillons est utilisée pour vérifier la conformité avec la teneur maximale.

4. Conservation et stockage des échantillons

Conserver les échantillons à une température ne pouvant modifier leur composition. Conserver les échantillons destinés à l’analyse de vitamines ou de substances particulièrement sensibles à la lumière dans des conditions telles qu’ils ne soient pas altérés par la lumière.

B. DISPOSITIONS CONCERNANT LES RÉACTIFS ET L’APPAREILLAGE UTILISÉS DANS LES MÉTHODES D’ANALYSE

1.

Sauf indication spécifique dans les méthodes d’analyse, tous les réactifs doivent être de qualité “pour analyse” (p.a.). Pour l’analyse des oligoéléments, la pureté des réactifs doit être contrôlée par un essai à blanc. Selon le résultat obtenu, une purification supplémentaire des réactifs peut être requise.

2.

Les opérations de mise en solution, de dilution, de rinçage ou de lavage mentionnées dans les méthodes d’analyse sans indication quant à la nature du solvant ou du diluant impliquent qu’il faut utiliser de l’eau. En règle générale, l’eau doit être déminéralisée ou distillée. Dans des cas particuliers, indiqués dans les méthodes d’analyse, elle doit être soumise à des procédés spécifiques de purification.

3.

Compte tenu de l’équipement usuel des laboratoires de contrôle, seuls les instruments et appareils spéciaux ou devant répondre à des conditions spécifiques sont mentionnés dans les méthodes d’analyse. Ce matériel doit être propre, tout particulièrement pour les déterminations de très faibles quantités de substances.

C. APPLICATION DES MÉTHODES D’ANALYSE ET EXPRESSION DES RÉSULTATS

1. Procédé d’extraction

Plusieurs méthodes déterminent un procédé d’extraction spécifique. En règle générale, des procédés d’extraction autres que celui visé dans la méthode peuvent être appliqués à condition que le procédé d’extraction appliqué ait une efficacité d’extraction équivalente avérée, pour la matrice analysée, à celle du procédé mentionné dans la méthode.

2. Procédé de purification

Plusieurs méthodes déterminent un procédé de purification spécifique. En règle générale, des procédés de purification autres que celui visé dans la méthode peuvent être appliqués, à condition qu’il soit prouvé que le procédé de purification appliqué donne des résultats d’analyse équivalents, pour la matrice analysée, à ceux que donne le procédé mentionné dans la méthode.

3. Nombre de déterminations

Si, lors de l’analyse de substances indésirables, le résultat de la première détermination est nettement (> 50 %) inférieur à la spécification à contrôler, il n’est pas nécessaire de procéder à une détermination supplémentaire, à condition que les procédures appropriées en matière de qualité aient été suivies. Dans les autres cas, une double analyse (deuxième détermination) est nécessaire pour exclure la possibilité d’une contamination croisée interne ou un mélange accidentel des échantillons. La moyenne des deux déterminations analytiques sert à approfondir l’évaluation.

Si, lors du contrôle des teneurs minimales ou maximales en additifs pour l’alimentation animale, le résultat de la première détermination est supérieur à la teneur minimale ou inférieure à la teneur maximale, il n’est pas nécessaire de procéder à une détermination supplémentaire, à condition que les procédures appropriées en matière de qualité aient été suivies. Dans les autres cas, une double analyse (deuxième détermination) est nécessaire pour exclure la possibilité d’une contamination croisée interne ou un mélange accidentel des échantillons. La moyenne des deux déterminations analytiques sert à approfondir l’évaluation.

Si, lors du contrôle de la teneur déclarée en une substance ou un ingrédient donné, le résultat de la première détermination confirme l’exactitude de la teneur déclarée (ce qui signifie que l’écart entre le résultat de l’analyse et la teneur déclarée se situe dans la plage admissible), il n’est pas nécessaire de procéder à des déterminations supplémentaires, à condition que les procédures appropriées en matière de qualité aient été suivies. Dans les autres cas, une double analyse (deuxième détermination) est nécessaire pour exclure la possibilité d’une contamination croisée interne ou un mélange accidentel des échantillons. La moyenne des deux déterminations analytiques sert à approfondir l’évaluation (l’écart entre le résultat de l’analyse et la teneur déclarée se situe dans la plage admissible).

Dans certains cas, l’écart admissible est défini par la législation, par exemple par le règlement (CE) no 767/2009 et le règlement (UE) 2019/4 du Parlement européen et du Conseil (1).

4. Mention de la méthode d’analyse appliquée

Le bulletin d’analyse doit mentionner la méthode d’analyse appliquée.

5. Indication du résultat de l’analyse

Le résultat de l’analyse doit être exprimé conformément aux indications données dans la méthode d’analyse avec un nombre approprié de chiffres significatifs, et être corrigé, si nécessaire, en fonction de la teneur en humidité de l’échantillon final avant sa préparation.

La plupart des teneurs réglementaires (la teneur maximale et la teneur minimale, par exemple) fixées par la législation de l’UE en matière d’alimentation animale se rapportent à des aliments pour animaux ayant une teneur en humidité de 12 %. Par conséquent, dans ces cas, pour évaluer le résultat de l’analyse effectuée sur l’échantillon au regard de la teneur réglementaire, le résultat de l’analyse doit d’abord être divisé par la teneur en matière sèche de l’échantillon (en %) et multiplié par 88, comme indiqué dans la formule suivante:

où:

Mc	:	teneur en humidité de l’échantillon (en %). 100 – Mc équivaut donc à la teneur en matière sèche de l’échantillon (en %).
Rana	:	résultat de l’analyse tel que mesuré sur l’échantillon.
R12 %	:	résultat pour un aliment ayant une teneur en humidité de 12 %; à évaluer au regard de la teneur réglementaire.

En outre, si les conditions suivantes sont remplies:

—	le résultat de l’analyse est nettement (> 50 %) inférieur ou supérieur à la spécification/mention d’étiquetage à contrôler (selon que la spécification/mention d’étiquetage est une teneur maximale ou minimale),

—

la teneur en humidité des aliments pour animaux échantillonnés est connue et il est possible de déterminer que le correction par la teneur en humidité ne changera pas l’évaluation, et à condition que les procédures appropriées en matière de qualité aient été suivies et que l’analyse vise uniquement à contrôler si les dispositions légales sont respectées, la correction par la teneur en humidité peut alors être omise (par exemple quand il n’y a pas de spécification ou de teneur réglementaire), sauf si elle est requise pour l’interprétation des résultats.

Si le résultat de l’analyse est corrigé en fonction de la teneur en humidité, l’incertitude de mesure correspondante doit aussi être corrigée avec la même procédure.

En cas de dosage de l’ergot de seigle ou d’impuretés botaniques nuisibles par examen microscopique/visuel, il n’est pas nécessaire de corriger par la teneur en humidité.

6. Incertitude de mesure de l’analyse et taux de récupération en cas d’analyse de substances indésirables

En ce qui concerne les substances indésirables au sens de la directive 2002/32/CE, un produit destiné à l’alimentation animale est considéré comme ne satisfaisant pas à la teneur maximale fixée lorsque le résultat de l’analyse, qui est la moyenne de deux déterminations indépendantes, rapporté à un aliment d’une teneur en humidité de 12 %, est jugé supérieur à la teneur maximale, compte tenu de l’incertitude de mesure élargie calculée au moyen d’un facteur d’élargissement de 2 donnant un niveau de confiance d’environ 95 % et de la correction de la récupération. La concentration analysée, corrigée au titre de la récupération et après soustraction de l’incertitude de mesure élargie, est donc utilisée pour l’évaluation de la conformité. Ce procédé est applicable uniquement dans les cas où la méthode d’analyse autorise l’estimation de l’incertitude de mesure et de la correction de la récupération (ce qui n’est pas requis, par exemple, dans le cas d’une analyse microscopique/visuelle).

Si le résultat de l’analyse de l’échantillon prélevé à des fins de recours dépasse la teneur maximale (compte non tenu de l’incertitude de mesure élargie), il confirme la non-conformité constatée avec l’échantillon témoin, en l’absence de règles nationales spécifiques en la matière.

Le résultat de l’analyse est rapporté comme suit (lorsque la méthode d’analyse appliquée permet d’estimer l’incertitude de mesure élargie):

a)

corrigé au titre de la récupération, le cas échéant et s’il y a lieu, et le taux de récupération doit être indiqué. Le taux de récupération doit être indiqué, sauf si la correction intrinsèque pour biais fait partie de la procédure, le biais étant la différence entre la valeur mesurée et la concentration de référence. La correction de la récupération n’est pas nécessaire lorsque le taux de récupération est compris entre 90 et 110 %;

b)	sous la forme “x +/– U”, où x est le résultat de l’analyse et U l’incertitude de mesure élargie, calculée à l’aide d’un facteur d’élargissement de 2 (2) qui donne un niveau de confiance d’environ 95 %.

Néanmoins, si le résultat de l’analyse est nettement (> 50 %) inférieur à la spécification à contrôler, et à condition que les procédures appropriées en matière de qualité aient été suivies et que l’analyse vise uniquement à contrôler si les dispositions légales sont respectées, la mention du taux de récupération et de l’incertitude de mesure élargie peut être omise (par exemple quand il n’y a pas de spécification ou de teneur réglementaire), sauf si l’incertitude de mesure est requise pour l’interprétation des résultats.

7. Incertitude de mesure de l’analyse et taux de récupération en cas d’analyse de la teneur en additifs pour l’alimentation animale

Aux fins du contrôle de la conformité avec les teneurs minimales et maximales autorisées en additifs pour l’alimentation animale, la présence d’un additif pour l’alimentation animale est considérée comme ne satisfaisant pas aux teneurs minimale et maximale fixées lorsque le résultat de l’analyse, qui est la moyenne de deux déterminations indépendantes, rapporté à un aliment d’une teneur en humidité de 12 %, est jugé:

—

supérieur à la teneur maximale, compte tenu de l’incertitude de mesure élargie et de la correction de la récupération. La concentration analysée (soit la moyenne de deux déterminations analytiques), corrigée au titre de la récupération et après soustraction de l’incertitude de mesure élargie, est donc utilisée pour l’évaluation de la conformité,

—

inférieur à la teneur minimale, compte tenu de l’incertitude de mesure élargie et de la correction de la récupération. La concentration analysée (soit la moyenne de deux déterminations analytiques), corrigée au titre de la récupération et après addition de l’incertitude de mesure élargie, est donc utilisée pour l’évaluation de la conformité.

Si le résultat de l’analyse de l’échantillon prélevé à des fins de recours dépasse la teneur maximale (compte non tenu de l’incertitude de mesure élargie), il confirme la non-conformité constatée avec l’échantillon témoin, en l’absence de règles nationales spécifiques en la matière.

Le résultat de l’analyse est rapporté comme suit (lorsque la méthode d’analyse appliquée permet d’estimer l’incertitude de mesure élargie):

a)

corrigé au titre de la récupération, le cas échéant et s’il y a lieu, et le taux de récupération doit être indiqué. Le taux de récupération doit être indiqué, sauf si la correction intrinsèque pour biais fait partie de la procédure, le biais étant la différence entre la valeur mesurée et la concentration de référence. La correction de la récupération n’est pas nécessaire lorsque le taux de récupération est compris entre 90 et 110 %;

b)	sous la forme “x +/– U”, où x est le résultat de l’analyse (moyenne de deux déterminations analytiques) et U l’incertitude de mesure élargie, calculée à l’aide d’un facteur d’élargissement de 2 (3) qui donne un niveau de confiance d’environ 95 %.

«ANNEXE III

MÉTHODES D’ANALYSE RELATIVES AU CONTRÔLE DE LA COMPOSITION DES MATIÈRES PREMIÈRES POUR ALIMENTS DES ANIMAUX ET DES ALIMENTS COMPOSÉS

A. DOSAGE DE L’HUMIDITÉ

1. Objet et champ d’application

La méthode permet de déterminer la teneur en humidité des aliments pour animaux. Dans le cas d’aliments pour animaux contenant des substances volatiles telles que des acides organiques, il a été observé qu’un nombre significatif de substances volatiles était dosée en même temps que la teneur en humidité.

Elle ne concerne pas l’analyse des produits laitiers en tant que matières premières pour aliments des animaux et aliments composés essentiellement composés de produits laitiers, l’analyse des graisses et des huiles animales et végétales, ni l’analyse des graines et des fruits oléagineux.

La teneur en humidité des graines oléagineuses doit être dosée au moyen de la méthode établie par la norme EN ISO 665 “Graines oléagineuses — Détermination de la teneur en eau et en matières volatiles”, étant entendu que le soja doit être broyé avant la détermination de la teneur en humidité.

2. Principe

L’échantillon est soumis à la dessiccation dans des conditions définies, variant en fonction de la nature de l’aliment pour animaux. La perte de poids est déterminée par pesée. Il est nécessaire de procéder à une prédessiccation lorsqu’il s’agit d’aliments solides qui ont une teneur en humidité élevée.

3. Appareillage

3.1.

Broyeur construit en matériau n’absorbant pas l’humidité, facile à nettoyer, permettant un broyage rapide et uniforme sans provoquer d’échauffement sensible, évitant au maximum le contact avec l’air extérieur et permettant de satisfaire aux exigences énoncées aux points 4.1.1 et 4.1.2 (par exemple, microbroyeurs à marteaux ou à refroidissement à eau, moulins à cônes démontables, broyeurs à mouvement lent ou à disques dentés).

3.2.

Balance d’analyse d’une précision de 1 mg.

3.3.

Récipients secs en métal inoxydable ou en verre munis d’un couvercle hermétique; surface utile permettant d’obtenir une répartition de la prise d’essai de 0,3 g par cm2.

3.4.

Étuve isotherme (± 2 °C) à chauffage électrique, assurant une régulation rapide de la température et convenablement ventilée (1).

3.5.

Étuve à vide, à chauffage électrique réglable, munie d’une pompe à huile et soit d’un dispositif à introduction d’air chaud déshydraté, soit d’un déshydratant (par exemple, de l’oxyde de calcium).

3.6.

Dessiccateur à plaque en métal ou en porcelaine, épaisse, perforée, contenant un déshydratant efficace.

4. Mode opératoire

NB:	Les opérations décrites au présent point doivent être effectuées immédiatement après l’ouverture des emballages contenant les échantillons. Les analyses doivent être effectuées au moins en double.

4.1. Préparation

4.1.1. Aliments pour animaux autres que ceux visés aux points 4.1.2 et 4.1.3

Prélever au moins 50 g de l’échantillon. Si nécessaire, broyer ou diviser de façon appropriée pour éviter toute variation de la teneur en humidité (voir le point 6).

4.1.2. Céréales et gruaux

Prélever au moins 50 g de l’échantillon. Moudre en particules dont au moins 50 % passent par un tamis à mailles de 0,5 mm et ne laissent pas plus de 10 % de refus sur le tamis à mailles rondes de 1 mm.

4.1.3. Aliments liquides ou pâteux, aliments constitués essentiellement de matières grasses

Prélever et peser, à 10 mg près, 25 g environ de l’échantillon, y ajouter une quantité appropriée de sable anhydre, pesée à 10 mg près, et mélanger jusqu’à obtention d’un produit homogène.

4.2. Dessiccation

Sécher un récipient (point 3.3) muni de son couvercle dans l’étuve à une température de 103 °C pendant 30 minutes +/– 1 minute. L’enlever de l’étuve et le laisser refroidir à température ambiante dans le dessiccateur (point 3.6).

4.2.1. Aliments pour animaux autres que ceux visés aux points 4.2.2 et 4.2.3

Tarer, à 1 mg près, le récipient muni de son couvercle. Peser, à 1 mg près, dans le récipient taré 5 g environ de l’échantillon et répartir uniformément la prise d’essai. Placer le récipient, sans son couvercle, dans l’étuve préchauffée à 103 °C. Pour éviter que la température de l’étuve ne descende trop, introduire le récipient en un minimum de temps. Laisser sécher durant 4 heures à partir du moment où l’étuve a de nouveau atteint la température de 103 °C. Ouvrir l’étuve, remettre immédiatement le couvercle sur le récipient, retirer celui-ci de l’étuve, laisser refroidir 30 à 45 minutes dans le dessiccateur (point 3.6) et peser à 1 mg près.

Dans le cas des aliments constitués essentiellement (> 50 %) d’huiles et graisses d’origine animale et végétale, effectuer une dessiccation complémentaire de 30 minutes dans l’étuve à 103 °C. L’écart entre les deux pesées ne peut excéder 0,1 % d’humidité.

4.2.2. Céréales, farines, gruaux et semoules

Tarer, à 0,5 mg près, le récipient muni de son couvercle. Peser, à 1 mg près, dans le récipient taré 5 g environ de l’échantillon broyé et répartir uniformément la prise d’essai. Placer le récipient, sans son couvercle, dans l’étuve préchauffée à 130 °C. Pour éviter que la température de l’étuve ne descende trop, introduire le récipient en un minimum de temps. Laisser sécher durant 2 heures à partir du moment où l’étuve a de nouveau atteint la température de 130 °C. Ouvrir l’étuve, remettre immédiatement le couvercle sur le récipient, retirer celui-ci de l’étuve, laisser refroidir 30 à 45 minutes dans le dessiccateur (point 3.6) et peser à 1 mg près.

4.2.3. Aliments composés pour animaux contenant plus de 4 % de saccharose ou de lactose: matières premières pour aliments des animaux tels que caroube, produits céréaliers hydrolysés, germes de malt, cossettes de betteraves, solubles de poisson et sucres

Tarer, à 0,5 mg près, le récipient muni de son couvercle. Peser, à 1 mg près, dans le récipient taré 5 g environ de l’échantillon et répartir uniformément la prise d’essai. Placer le récipient, sans son couvercle, dans l’étuve à vide (point 3.5) préchauffée à une température comprise entre 80 et 85 °C. Pour éviter que la température de l’étuve ne descende trop, introduire le récipient en un minimum de temps.

Amener la pression à 100 torrs et laisser sécher à cette pression durant 4 heures, soit sous un courant d’air sec et chaud, soit à l’aide d’un déshydratant (300 g environ pour 20 échantillons). Dans ce dernier cas, couper la connexion avec la pompe à vide lorsque la pression prescrite est atteinte. Compter la durée de séchage à partir du moment où l’étuve a de nouveau atteint la température de 80 à 85 °C. Ramener ensuite avec précaution l’étuve à la pression atmosphérique. Ouvrir l’étuve, remettre immédiatement le couvercle sur le récipient, retirer le récipient de l’étuve, laisser refroidir durant 30 à 45 minutes dans le dessiccateur (point 3.6) et peser à 1 mg près. Procéder à une dessiccation complémentaire de 30 minutes dans l’étuve à vide à la température de 80 à 85 °C et peser de nouveau. L’écart entre les deux pesées ne peut excéder 0,1 % d’humidité.

4.3. Prédessiccation (partielle)

Il est nécessaire d’effectuer une dessiccation partielle des aliments “humides” ayant une fraction massique inférieure à 85 % de matière sèche [par exemple, le fourrage, les rations uniques et les aliments (non) liquides] avant de les broyer finement afin d’analyser leurs substances stables; la dessiccation partielle des substances instables n’est pas possible.

La dessiccation partielle peut être effectuée soit au moyen d’une étuve à air pulsé ou à micro-ondes, soit par cryodessiccation. Sauf dans le cas de la dessiccation partielle par cryodessiccation, l’objectif est de dessécher l’aliment tout en gardant la température de l’échantillon en dessous de 60 °C de manière à altérer le moins possible sa composition chimique. La dessiccation à des températures supérieures à 60 °C entraîne des modifications chimiques dans l’aliment (telles qu’une dégradation des protéines). On maintient l’aliment desséché à température ambiante pendant environ 15 minutes avant de mesurer la matière partiellement sèche de manière à minimiser le changement d’humidité pouvant subvenir pendant le broyage et le stockage. La dessiccation à des températures inférieures à 60 °C n’enlève pas toute l’eau de l’aliment; par conséquent, la dessiccation partielle (initiale) ne permet pas d’obtenir la matière sèche totale de l’aliment. Après dessiccation, le sous-échantillon est broyé et la matière sèche (finale) de l’échantillon partiellement sec est analysée (l’humidité résiduelle représentant de 3 à 15 %) lorsque les autres constituants chimiques sont déterminés.

Par conséquent, une procédure en deux étapes de détermination de la matière sèche est recommandée. Il faut d’abord déterminer la teneur en matière sèche partielle (s’il y a moins de 85 % de matière sèche), ensuite déterminer la teneur résiduelle en matière sèche sur une prise d’essai broyée et multiplier la matière sèche partielle par la matière sèche résiduelle pour déterminer la teneur en matière sèche totale.

5. Calcul des résultats

La teneur en humidité (X), exprimée en pourcentage de l’échantillon, est donnée par les formules suivantes:

5.1. Dessiccation sans prédessiccation

où:

m	=	poids initial, en grammes, de la prise d’essai,
m0	=	poids, en grammes, de la prise d’essai sèche.

5.2. Dessiccation avec prédessiccation (2)

où:

m	=	poids initial, en grammes, de la prise d’essai,
m1	=	poids, en grammes, de la prise d’essai après prédessiccation,
m2	=	poids, en grammes, de la prise d’essai après broyage ou mouture,
m0	=	poids, en grammes, de la prise d’essai sèche.

5.3. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur un même échantillon ne peut dépasser 0,2 % de l’humidité (valeur absolue), sauf pour les aliments humides pour animaux et les objets à mâcher pour chiens, pour lesquels la différence ne peut dépasser 0,5 % de l’humidité (valeur absolue).

6. Observation

Si un broyage se révèle nécessaire et s’il s’avère que celui-ci entraîne une variation de la teneur en humidité du produit, les résultats de l’analyse des composants de l’aliment doivent être corrigés en fonction de la teneur en humidité de l’échantillon initial.

B. DOSAGE DE L’HUMIDITÉ DANS LES GRAISSES ET LES HUILES ANIMALES ET VÉGÉTALES

1. Objet et champ d’application

La méthode permet de déterminer la teneur en humidité (eau et autres matières volatiles) des graisses et des huiles animales et végétales.

2. Principe

L’échantillon est soumis à la dessiccation à 103 °C jusqu’à cessation de la diminution de la masse (la perte de masse entre deux pesées successives doit être inférieure ou égale à 1 mg). La perte de poids est déterminée par pesée.

3. Appareillage

3.1.

Récipient à fond plat, en matériau résistant à la corrosion, d’un diamètre de 8 à 9 cm et d’une hauteur de 3 cm environ.

3.2.

Thermomètre, avec bulbe renforcé, et chambre de dilatation à l’extrémité supérieure, gradué de 80 °C environ à 110 °C au moins, d’une longueur de 10 cm environ.

3.3.

Bain de sable ou plaque chauffante électrique.

3.4.

Dessiccateur, contenant un déshydratant efficace.

3.5.

Balance d’analyse.

4. Mode opératoire

Peser, à 1 mg près, 20 g de l’échantillon homogénéisé dans le récipient (point 3.1) sec et taré contenant le thermomètre (point 3.2). Chauffer sur le bain de sable ou la plaque chauffante (point 3.3), en agitant constamment à l’aide du thermomètre, de façon que la température atteigne 90 °C en 7 minutes environ.

Réduire l’intensité du chauffage en suivant la fréquence avec laquelle les bulles montent du fond du récipient. La température ne doit pas dépasser 105 °C. Continuer à agiter en raclant le fond du récipient jusqu’à cessation de la formation de bulles.

Pour assurer l’élimination complète de l’humidité, répéter à plusieurs reprises le chauffage à 103 °C ± 2 °C, en refroidissant à 93 °C entre les chauffages successifs. Laisser refroidir ensuite dans le dessiccateur (point 3.4) jusqu’à température ambiante et peser. Répéter cette opération jusqu’à ce que la perte de poids entre deux pesées successives n’excède plus 2 mg.

NB:	Une augmentation de poids de l’échantillon après chauffage répété indique une oxydation de la graisse. Si cela se produit, calculer le résultat à partir de la pesée effectuée immédiatement avant le début de l’augmentation de poids.

5. Calcul des résultats

La teneur en humidité (X), exprimée en pourcentage de l’échantillon, est donnée par la formule suivante:

où:

m	=	poids, en grammes, de la prise d’essai,
m1	=	poids, en grammes, du récipient avec son contenu, avant le chauffage,
m2	=	poids, en grammes, du récipient avec son contenu, après le chauffage.

Les résultats inférieurs à 0,05 % doivent être rapportés par la mention “moins de 0,05 %”.

Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur un même échantillon ne peut dépasser 0,1 % en valeur absolue.

C. DÉTERMINATION DE LA TENEUR EN AZOTE ET CALCUL DE LA TENEUR EN PROTÉINES BRUTES

1. Objet et champ d’application

La méthode permet de déterminer la teneur en protéines brutes des aliments pour animaux à partir de la teneur en azote dosée selon la méthode de Kjeldahl (3).

2. Principe

L’échantillon est minéralisé à l’acide sulfurique en présence d’un catalyseur. La solution acide est alcalinisée par une solution d’hydroxyde de sodium. L’ammoniac est entraîné par distillation et recueilli dans une quantité déterminée d’acide sulfurique dont l’excès est titré par une solution étalon d’hydroxyde de sodium.

Autre possibilité: l’ammoniac libéré est distillé dans un excès de solution d’acide borique, après quoi l’ammoniac combiné avec l’acide borique est titré par une solution d’acide chlorhydrique ou d’acide sulfurique.

3. Réactifs

3.1.

Sulfate de potassium.

3.2.

Catalyseur: oxyde de cuivre (II) CuO ou sulfate de cuivre (II) pentahydraté CuSO4 5H2O.

3.3.

Zinc en granulés.

3.4.

Acide sulfurique, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5.

Acide sulfurique, solution étalon volumétrique, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6.

Acide sulfurique, solution étalon volumétrique, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7.

Acide sulfurique, solution étalon volumétrique, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8.

Rouge de méthyle (indicateur) dissoudre 300 g de rouge de méthyle dans 100 ml d’éthanol, σ = 95-96 % (v/v).

3.9.

Solution d’hydroxyde de sodium (utilisation possible de la qualité technique) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %);

3.10.

Hydroxyde de sodium, solution étalon volumétrique, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11.

Hydroxyde de sodium, solution étalon volumétrique, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12.

Granulés de pierre ponce lavés à l’acide chlorhydrique et calcinés.

3.13.

Acétanilide (point de fusion = 114 °C, teneur N = 10,36 %).

3.14.

Saccharose (exempt d’azote).

3.15.

Acide borique (H3BO3).

3.16.

Solution d’indicateur de rouge de méthyle: dissoudre 100 mg de rouge de méthyle dans 100 ml d’éthanol ou de méthanol.

3.17.

Solution de vert de bromocrésol: dissoudre 100 mg de vert de bromocrésol dans 100 ml d’éthanol ou de méthanol.

3.18.

Solution d’acide borique (de 10 g/l à 40 g/l en fonction de l’appareillage utilisé). En cas de détection colorimétrique au point d’équivalence, les indicateurs (rouge de méthyle et vert de bromocrésol) doivent être ajoutés aux solutions d’acide borique. Si 1 litre de solution d’acide borique est préparé, avant ajustement du volume, ajouter 7 ml de solution d’indicateur de rouge de méthyle (point 3.16) et 10 ml de solution de vert de bromocrésol (point 3.17). En fonction de l’eau utilisée, le pH de la solution d’acide borique peut varier d’un lot à l’autre. Le pH de la solution d’acide borique doit être compris entre 4,3 et 4,7. Il est fréquent qu’il faille opérer un ajustement au moyen d’un petit volume d’alcali pour obtenir un blanc positif. NB: L’ajout d’environ 3 à 4 ml de NaOH (point 3.11) dans 1 litre de solution d’acide borique à 10 g/l donne généralement de bons ajustements. Conserver la solution à température ambiante et la protéger de la lumière et des sources de vapeurs d’ammoniac pendant sa conversation.

3.19.

Acide chlorhydrique, solution étalon volumétrique, c(HCL) = 0,10 mol/l. NB: Il est permis de modifier les concentrations des solutions volumétriques (points 3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 et 3.19), à condition d’apporter les corrections nécessaires dans les calculs. Les concentrations devraient toujours être exprimées par des chiffres à quatre décimales.

4. Appareillage

Appareils permettant de réaliser les opérations de minéralisation, de distillation et de titrage selon la méthode de Kjeldahl.

5. Mode opératoire

5.1. Minéralisation

Peser, à 0,001 g près, 1 g de l’échantillon et introduire la prise d’essai dans le ballon de l’appareil de minéralisation. Ajouter 15 g de sulfate de potassium (point 3.1), une quantité appropriée de catalyseur (point 3.2) [0,3 à 0,4 g d’oxyde de cuivre (II) ou 0,9 à 1,2 g de sulfate de cuivre (II) pentahydraté], 25 ml d’acide sulfurique (point 3.4) et, si nécessaire, quelques grains de pierre ponce (point 3.12) et mélanger.

Chauffer le ballon, avec modération dans un premier temps, en agitant de temps en temps, si nécessaire, jusqu’à carbonisation de la masse et disparition de l’écume; chauffer ensuite plus intensément jusqu’à ébullition régulière du liquide. Le chauffage est approprié si l’acide en ébullition se condense sur la paroi du ballon. Éviter la surchauffe des parois et l’adhérence de particules organiques.

Lorsque la solution apparaît limpide et vert clair, maintenir l’ébullition durant 2 heures puis laisser refroidir.

5.2. Distillation

Ajouter avec précaution une quantité suffisante d’eau pour garantir une dissolution complète des sulfates. Laisser refroidir et ajouter, s’il le faut, quelques grains de zinc (point 3.3). Procéder conformément au point 5.2.1 ou 5.2.2.

5.2.1. Distillation dans de l’acide sulfurique

Introduire, dans le flacon collecteur de l’appareil à distiller, 25 ml exactement mesurés d’acide sulfurique (point 3.5 ou 3.7), selon la teneur présumée en azote. Introduire quelques gouttes d’indicateur au rouge de méthyle (point 3.8).

Connecter le ballon de minéralisation au réfrigérant de l’appareil à distiller et plonger l’extrémité du réfrigérant sur une hauteur de 1 cm au moins dans le liquide du flacon collecteur (voir observation point 8.3). Verser lentement 100 ml de solution d’hydroxyde de sodium (point 3.9) dans le ballon de minéralisation sans provoquer de perte d’ammoniac (voir observation point 8.1). Chauffer le ballon jusqu’à distillation complète de l’ammoniac.

5.2.2. Distillation dans de l’acide borique

Lorsque le titrage de la teneur en ammoniac du distillat est effectué manuellement, le mode opératoire décrit ci-après est applicable. Lorsque l’unité de distillation est entièrement automatisée, y compris pour ce qui concerne le titrage de la teneur en ammoniac du distillat, suivre les instructions d’utilisation de l’unité de distillation fournies par le fabricant.

Placer un flacon collecteur contenant de 25 à 30 ml de solution d’acide borique (point 3.18) en sortie du réfrigérant de manière telle que le tube d’évacuation soit plongé dans l’excès de solution d’acide borique. Régler l’unité de distillation pour obtenir 50 ml de solution d’hydroxyde de sodium (point 3.9). Manier l’unité de distillation conformément aux instructions du fabricant et éliminer l’ammoniac libéré par distillation en ajoutant la solution d’hydroxyde de sodium. Recueillir le distillat dans la solution d’acide borique. La quantité de distillat (durée de distillation à la vapeur) dépend de la quantité d’azote dans l’échantillon. Suivre les instructions du fabricant.

NB:	Une unité de distillation semi-automatique effectue automatiquement l’addition d’excès d’hydroxyde de sodium et la distillation à la vapeur.

5.3. Titrage

Procéder conformément au point 5.3.1 ou 5.3.2.

5.3.1. Acide sulfurique

Titrer, dans le flacon collecteur, l’excès d’acide sulfurique par la solution d’hydroxyde de sodium (point 3.10 ou 3.11), selon la concentration de l’acide sulfurique utilisé, jusqu’à atteindre le point d’équivalence.

5.3.2. Acide borique

Titrer le contenu du flacon collecteur par la solution étalon volumétrique d’acide chlorhydrique (point 3.19) ou par la solution étalon volumétrique d’acide sulfurique (point 3.6) au moyen d’une burette et lire la quantité de solution titrée utilisée.

En cas de détection colorimétrique au point d’équivalence, le point d’équivalence est atteint dès la première trace de couleur rose dans le contenu. Estimer le contenu de la burette à 0,05 ml près. Un agitateur magnétique illuminé ou un détecteur photométrique peut faciliter la visualisation du point d’équivalence.

Cette étape peut être réalisée automatiquement au moyen d’une unité de distillation à titrage automatique.

Suivre les instructions du fabricant lors de l’utilisation d’une unité de distillation ou d’une unité de distillation avec titreur.

NB:	En cas d’utilisation d’un système de titrage automatique, le titrage débute immédiatement après le démarrage de la distillation et la solution d’acide borique à 1 % (point 3.18) est utilisée.

En cas d’utilisation d’une unité de distillation entièrement automatique, le titrage automatique de l’ammoniac peut se faire par détection au point d’équivalence au moyen d’un système potentiométrique (pH).

Dans ce cas, un titreur automatique à pH-mètre est utilisé. Le pH-mètre doit être correctement étalonné dans une plage allant de pH 4 à pH 7 conformément aux procédures d’étalonnage habituelles.

Le point d’équivalence du titrage est atteint à pH 4,6, qui est le point d’inflexion de la courbe de titrage.

5.4. Essai à blanc

Pour confirmer que les réactifs sont exempts d’azote, effectuer un essai à blanc (minéralisation, distillation et titrage) en utilisant 1 g de saccharose (point 3.14) en lieu en place de l’échantillon.

6. Calcul des résultats

Les calculs sont effectués conformément au point 6.1 ou 6.2.

6.1. Calcul pour le titrage conformément au point 5.3.1

La teneur en protéines brutes, exprimée sous forme de pourcentage en poids, se calcule selon la formule suivante:

où:

V0	=	volume (ml) de NaOH (point 3.10 ou 3.11) utilisé dans l’essai à blanc,
V1	=	volume (ml) de NaOH (point 3.10 ou 3.11) utilisé pour le titrage de l’échantillon,
c	=	concentration (mol/l) de l’hydroxyde de sodium (point 3.10 ou 3.11),
m	=	poids (g) d’échantillon.

6.2. Calcul pour le titrage conformément au point 5.3.2

6.2.1. Titrage par une solution d’acide chlorhydrique

La teneur en protéines brutes, exprimée sous forme de pourcentage en poids, se calcule selon la formule suivante:

où:

m	=	poids (g) de la prise d’essai,
c	=	concentration (mol/l) de la solution étalon volumétrique d’acide chlorhydrique (point 3.19),
V0	=	volume (ml) d’acide chlorhydrique utilisé dans l’essai à blanc,
V1	=	volume (ml) d’acide chlorhydrique utilisé dans la prise d’essai.

6.2.2. Titrage par une solution d’acide sulfurique

La teneur en protéines brutes, exprimée sous forme de pourcentage en poids, se calcule selon la formule suivante:

formule dans laquelle

m	=	poids (g) de la prise d’essai,
c	=	concentration (mol/l) de la solution étalon volumétrique d’acide sulfurique (point 3.6),
V0	=	volume (ml) d’acide sulfurique (point 3.6) utilisé dans l’essai à blanc,
V1	=	volume (ml) d’acide sulfurique (point 3.6) utilisé dans la prise d’essai.

7. Vérification de la méthode

7.1. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur le même échantillon ne peut dépasser:

—	0,4 % en valeur absolue pour les teneurs en protéines brutes inférieures à 20 %,

—	2,0 % par rapport au résultat le plus élevé, pour les teneurs en protéines brutes comprises entre 20 et 40 %,

—	0,8 % en valeur absolue pour les teneurs supérieures à 40 %.

7.2. Reproductibilité

La différence entre les résultats de deux dosages effectués sur le même échantillon dans des laboratoires différents ne peut dépasser:

—	1,8 % en valeur absolue pour les teneurs en protéines brutes inférieures à 20 %,

—	9,0 % par rapport au résultat le plus élevé, pour les teneurs en protéines brutes comprises entre 20 et 40 %,

—	3,6 % en valeur absolue pour les teneurs supérieures à 40 %.

7.3. Exactitude

Effectuer l’analyse (minéralisation, distillation et titrage) à l’aide d’une quantité appropriée d’acétanilide (point 3.13) (par exemple de 0,2 à 0,3 g) en présence de 1 g de saccharose (point 3.14); 1 g d’acétanilide consomme 14,80 ml d’acide sulfurique (point 3.5). La récupération doit être de 99 % au moins.

8. Observations

8.1.

L’appareil peut être de type manuel, semi-automatique ou automatique. Si l’appareil nécessite un transfert entre les étapes de minéralisation et de distillation, ce transfert doit être effectué sans perte. Si le ballon de l’appareil à distiller n’est pas équipé d’un entonnoir à robinet, ajouter l’hydroxyde de sodium immédiatement avant la connexion du ballon au réfrigérant en versant lentement le liquide le long de la paroi.

8.2.

Si le produit minéralisé se solidifie, recommencer la détermination en utilisant une quantité d’acide sulfurique (point 3.4) plus grande que celle indiquée au point 5.1.

8.3.

Pour les produits à faible teneur en azote, le volume d’acide sulfurique (point 3.7) à mettre dans le ballon collecteur peut être réduit, si nécessaire, à 10 ou à 15 ml et porté à 25 ml par addition d’eau.

8.4.

Pour les analyses de routine, d’autres méthodes d’analyse peuvent être appliquées pour le dosage des protéines brutes, mais la méthode de Kjeldahl décrite au présent point C est la méthode de référence. L’équivalence entre les résultats de la méthode de substitution (par exemple, la méthode de Dumas) et ceux de la méthode de référence doit être démontrée pour chaque matrice séparément. Étant donné que, même après vérification de l’équivalence, les résultats obtenus au moyen d’une méthode de substitution peuvent s’écarter légèrement des résultats qui auraient été obtenus au moyen de la méthode de référence, il est nécessaire de mentionner sur le bulletin d’analyse la méthode d’analyse appliquée pour le dosage des protéines brutes.

D. DOSAGE DE L’URÉE

1. Objet et champ d’application

La méthode permet de déterminer la teneur en urée utilisée comme additif dans l’alimentation des ruminants.

2. Principe

L’échantillon est mis en suspension dans de l’eau en présence d’un défécant. La suspension est filtrée. La teneur en urée du filtrat est déterminée, après addition de 4-diméthylaminobenzaldéhyde (4-DMAB), par mesure de la densité optique à la longueur d’onde de 420 mm.

3. Réactifs

3.1.

Solution de 4-diméthylaminobenzaldéhyde: dissoudre 1,6 g de 4-DMAB dans 100 ml d’éthanol à 96 % et ajouter 10 ml d’acide chlorhydrique (ρ20 1,19 g/ml). Ce réactif se conserve au maximum deux semaines.

3.2.

Solution de Carrez I: dissoudre dans l’eau 21,9 g d’acétate de zinc Zn(CH3 COO)2 2H2O et 3 g d’acide acétique glacial. Ajuster à 100 ml avec de l’eau.

3.3.

Solution de Carrez II: dissoudre dans l’eau 10,6 g de ferrocyanure de potassium K4Fe(CN)6 3H2O. Ajuster à 100 ml avec de l’eau.

3.4.

Charbon actif n’adsorbant pas l’urée (à contrôler).

3.5.

Urée, solution à 0,1 % (p/v).

4. Appareillage

4.1.

Mélangeur (culbuteur): environ 35 à 40 retournements par minute.

4.2.

Tubes à essais: 160 × 16 mm, à bouchon rodé.

4.3.

Spectrophotomètre.

5. Mode opératoire

5.1. Analyse de l’échantillon

Peser, à 1 mg près, 2 g de l’échantillon et les introduire avec 1 g de charbon actif (point 3.4) dans un flacon jaugé de 500 ml. Ajouter 400 ml d’eau et 5 ml de solution de Carrez I (point 3.2), agiter pendant environ 30 secondes et ajouter ensuite 5 ml de solution de Carrez II (point 3.3). Mélanger durant 30 minutes dans le culbuteur. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau, agiter et filtrer.

Prélever 5 ml des filtrats limpides et incolores, les introduire dans les tubes à essais à bouchon rodé, ajouter 5 ml de solution de 4-DMAB (point 3.1) et mélanger. Placer les tubes dans un bain d’eau à 20 °C (+/– 4 °C). Après 15 minutes, mesurer la densité optique de la solution de l’échantillon au spectrophotomètre à 420 nm. Comparer avec la solution de l’essai à blanc des réactifs.

5.2. Courbe d’étalonnage

Prélever des volumes de 1, 2, 4, 5 et 10 ml de la solution d’urée (point 3.5), les introduire dans des fioles jaugées de 100 ml et ajuster au trait de jauge avec de l’eau. Prélever 5 ml de chaque solution, y ajouter chaque fois 5 ml de solution de 4-DMAB (point 3.1), homogénéiser et mesurer la densité optique comme indiqué plus haut par comparaison avec une solution de référence contenant 5 ml de 4-DMAB et 5 ml d’eau exempte d’urée. Tracer la courbe d’étalonnage.

6. Calcul des résultats

Déterminer la quantité d’urée de la prise d’essai en se référant à la courbe d’étalonnage.

Exprimer le résultat en mg d’urée par kg d’échantillon.

7. Évaluation de la méthode

7.1. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon dans le même laboratoire et par le même analyste ne doit pas dépasser:

—

à 420 nm — 50 % du résultat supérieur pour les teneurs en urée comprises entre 3 000 mg/kg et moins de 5 000 mg/kg, — 25 % du résultat supérieur pour les teneurs en urée comprises entre 5 000 mg/kg et moins de 7 000 mg/kg, — 20 % du résultat supérieur pour les teneurs en urée supérieures ou égales à 7 000 mg/kg;

—

à 435 nm — 40 % du résultat supérieur pour les teneurs en urée comprises entre 3 000 mg/kg et moins de 5 000 mg/kg, — 25 % du résultat supérieur pour les teneurs en urée comprises entre 5 000 mg/kg et moins de 9 000 mg/kg, — 5 % du résultat supérieur pour les teneurs en urée supérieures ou égales à 9 000 mg/kg.

7.2. Reproductibilité

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées sur le même échantillon dans des laboratoires différents et/ou par des opérateurs différents ne peut dépasser:

—	à 420 nm — 3 000 mg/kg, en valeur absolue, pour les teneurs en urée comprises entre 3 000 mg/kg et moins de 12 000 mg/kg, — 4 500 mg/kg, en valeur absolue, pour les teneurs en urée supérieures ou égales à 12 000 mg/kg;

—	à 435 nm — 50 % du résultat supérieur pour les teneurs en urée comprises entre 3 000 mg/kg et moins de 8 000 mg/kg, — 25 % du résultat supérieur pour les teneurs en urée supérieures ou égales à 8 000 mg/kg.

8. Résultats d’une étude collaborative

Un exercice de comparaison interlaboratoire a été organisé dans l’UE et a rassemblé 18 laboratoires. Cinq matériaux positifs d’aliments composés destinés aux ruminants (appelés MAT dans les tableaux 1 et 2) ont été analysés (1 analyse) sous forme de doublets en aveugle et un blanc d’aliments composés destinés aux ruminants a été analysé en simple.

Les calculs des limites de répétabilité ® et de reproductibilité ®, telles que définies par les lignes directrices internationales, ont été effectués, après le retrait des valeurs aberrantes, en recourant à l’analyse de variance des valeurs valides.

Les chiffres calculés de performance de la méthode (répétabilité, reproductibilité) sont présentés dans les tableaux ci-dessous. Aucun faux positif ou négatif n’a été découvert parmi les échantillons testés (y compris le blanc).

Tableau 1

Caractéristiques des performances de la méthode pour l’urée, mesurées à λ = 420 nm dans toutes les matières premières

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Ovins	Bovins	Ovins	Ovins	Bovins
Fraction massique cible (mg kg–1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Fraction massique moyenne (mg kg–1)	4 241	6 993	7 830	9 962	12 071
Écart type de reproductibilité, sR (mg kg–1)	1 141	1 303	985	994	1 711
Écart type de répétabilité, sr (mg kg–1)	723	601	549	712	737
Écart type relatif de reproductibilité, RSDR (%)	27	19	13	10	14
Écart type relatif de répétabilité RSDr (%)	17	9	7	7	6
Limite de reproductibilité, R [R = 2,8 × sR ]	3 195	3 649	2 759	2 784	4 790
Limite de répétabilité, r [r = 2,8 × sr ]	2 024	1 684	1 536	1 994	2 064

Tableau 2

Caractéristiques des performances de la méthode pour l’urée, mesurées à λ = 435 nm dans toutes les matières premières

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Ovins	Bovins	Ovins	Ovins	Bovins
Fraction massique cible (mg kg–1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Fraction massique moyenne (mg kg–1)	4 101	6 467	7 890	10 062	11 642
Écart type de reproductibilité, sR (mg kg–1)	706	1 194	675	745	1 378
Écart type de répétabilité, sr (mg kg–1)	570	628	613	196	167
Écart type relatif de reproductibilité, RSDR (%)	17	18	9	7	12
Écart type relatif de répétabilité RSDr (%)	14	10	8	2	1
Limite de reproductibilité, R [R = 2,8 × sR ]	1 977	3 344	1 889	2 087	3 859
Limite de répétabilité, r [r = 2,8 × sr ]	1 596	1 759	1 715	549	467

9. Observations

9.1.

Pour les teneurs en urée supérieures à 3 %, réduire la prise d’essai à 1 g ou diluer la solution initiale pour ne pas avoir plus de 50 mg d’urée dans 500 ml.

9.2.

Pour les faibles teneurs en urée, augmenter la prise d’essai pour autant que le filtrat reste limpide et incolore.

9.3.

Les résultats ci-dessus des essais interlaboratoires ne montrent pas d’écart significatif de précision entre l’urée mesurée à 420 nm et l’urée mesurée à 435 nm.

E. DOSAGE DES ACIDES AMINÉS (À L’EXCEPTION DU TRYPTOPHANE)

Les méthodes d’analyse à appliquer pour doser les acides aminés (à l’exception du tryptophane) sont celles prévues par:

—	la norme EN ISO 13903 “Aliments des animaux — Dosage de la teneur en acides aminés”,

—	la norme EN ISO 17180 “Aliments des animaux — Détermination de la teneur en lysine, méthionine et thréonine dans les acides aminés industriels et les pré-mélanges” (4),

—	la méthode d’analyse décrite aux points 1 à 10 ci-après.

1. Objet et champ d’application

La méthode permet de doser les acides aminés libres (de synthèse et naturels) et totaux (liés dans des peptides et libres) dans les aliments pour animaux, les aliments composés et les prémélanges contenant moins de 10 % (5) de chaque acide aminé au moyen d’un analyseur d’acides aminés. Elle s’applique aux acides aminés suivants: cyst(é)ine, méthionine, lysine, thréonine, alanine, arginine, acide aspartique, acide glutamique, glycine, histidine, isoleucine, leucine, phénylalanine, proline, serine, tyrosine et valine.

La méthode ne fait pas de distinction entre les différents sels des acides aminés et ne permet pas de différencier les formes D et L des acides aminés. Elle ne convient pas pour le dosage du tryptophane et des analogues hydroxylés des acides aminés.

2. Principe

2.1. Acides aminés libres

Les acides aminés libres sont extraits à l’aide d’acide chlorhydrique dilué. Les macromolécules azotées coextraites sont précipitées à l’aide d’acide sulfosalicylique et éliminées par filtration. La solution filtrée est ajustée à pH 2,20. Les acides aminés sont séparés par chromatographie par échange d’ions et dosés par réaction avec la ninhydrine et détection photométrique à 570 nm.

2.2. Acides aminés totaux

Le mode opératoire dépend des acides aminés à examiner. La cyst(é)ine et la méthionine doivent être oxydées pour devenir respectivement de l’acide cystéique et de la méthionine sulfone avant hydrolyse. La tyrosine doit être dosée dans l’hydrolysat d’échantillons non oxydés. Tous les autres acides aminés mentionnés au point 1 (Objet et champ d’application) peuvent être dosés soit dans un échantillon oxydé, soit dans un échantillon non oxydé.

L’oxydation s’effectue à 0 °C à l’aide d’un mélange d’acide performique et de phénol. L’excédent de réactif d’oxydation est décomposé à l’aide de disulfite de sodium. L’échantillon oxydé ou non oxydé est hydrolysé à l’aide d’acide chlorhydrique (point 3.20) pendant 23 heures. L’hydrolysat est ajusté à pH 2,20. Les acides aminés sont séparés par chromatographie par échange d’ions et dosés par réaction à la ninhydrine et détection photométrique à 570 nm (440 nm pour la proline).

3. Réactifs

Utiliser de l’eau bidistillée ou de l’eau de qualité équivalente (conductivité < 10 μS)

3.1.

Peroxyde d’hydrogène, p (p/p) = 30 %.

3.2.

Acide formique, p (p/p) = 98-100 %.

3.3.

Phénol.

3.4.

Disulfite de disodium.

3.5.

Hydroxyde de sodium.

3.6.

Acide 5-sulfosalicylique dihydraté.

3.7.

Acide chlorhydrique, densité approximative de 1,18 g/ml.

3.8.

Citrate de tri-sodium dihydraté.

3.9.

2,2’-Thiodiéthanol (thiodiglycol).

3.10.

Chlorure de sodium.

3.11.

Ninhydrine.

3.12.

Éther de pétrole, intervalle d’ébullition: 40-60 °C.

3.13.

Norleucine ou autre composé pouvant être utilisé comme étalon interne.

3.14.

Azote gazeux (< 10 ppm d’oxygène).

3.15.

1-Octanol.

3.16.

Acides aminés.

3.16.1.

Substances étalons des acides aminés visés au point 1 (Objet et champ d’application). Composés purs ne contenant pas d’eau de cristallisation. Sécher sous vide sur P2O5 ou H2SO4 pendant une semaine avant utilisation.

3.16.2.

Acide cystéique.

3.16.3.

Méthionine sulfone.

3.17.

Solution d’hydroxyde de sodium, c = 7,5 mol/l: dissoudre 300 g de NaOH (point 3.5) dans de l’eau et ajuster à 1 litre.

3.18.

Solution d’hydroxyde de sodium, c = 1 mol/l: dissoudre 40 g de NaOH (point 3.5) dans de l’eau et ajuster à 1 litre.

3.19.

Solution d’acide formique-phénol: mélanger 889 g d’acide formique (point 3.2) et 111 g d’eau en ajoutant 4,73 g de phénol (point 3.3).

3.20.

Mélange à hydrolyser, c = 6 mol HCl/l contenant 1 g de phénol/l: ajouter 1 g de phénol (point 3.3) à 492 ml de HCl (point 3.7) et ajuster à 1 litre avec de l’eau.

3.21.

Mélange d’extraction, c = 0,1 mol HCl/l contenant 2 % de thiodiglycol: prendre 8,2 ml de HCl (point 3.7), diluer dans environ 900 ml d’eau, ajouter 20 ml de thiodiglycol (point 3.9) et ajuster à 1 litre avec de l’eau (ne pas mélanger directement points 3.7 et 3.9).

3.22.

Acide 5-sulfosalicylique, ß = 6 %: dissoudre 60 g d’acide 5-sulfosalicylique (point 3.6) dans de l’eau et ajuster à 1 litre avec de l’eau.

3.23.

Mélange d’oxydation (acide performique-phénol): mélanger 0,5 ml de peroxyde d’hydrogène (point 3.1) avec 4,5 ml d’une solution de phénol et d’acide formique (point 3.19) dans un petit bécher. Incuber à une température de 20 à 30 °C pendant une heure pour obtenir de l’acide performique, laisser refroidir ensuite sur un bain d’eau glacée (15 minutes) avant de l’ajouter à l’échantillon. Attention: éviter tout contact avec la peau et porter des vêtements de protection.

3.24.

Tampon au citrate, c = 0,2 mol de Na+/l, pH = 2,20: dissoudre 19,61 g de citrate de sodium (point 3.8), 5 ml de thiodiglycol (point 3.9), 1 g de phénol (point 3.3) et 16,50 ml de HCl (point 3.7) dans environ 800 ml d’eau. Ajuster le pH à 2,20. Ajuster à 1 litre avec de l’eau.

3.25.

Tampons d’élution préparés conformément aux prescriptions prévues pour l’analyseur (point 4.9).

3.26.

Réactif à la ninhydrine préparé conformément aux prescriptions prévues pour l’analyseur (point 4.9).

3.27.

Solutions étalons d’acides aminés. Conserver ces solutions à une température inférieure à 5 °C.

3.27.1.

Solution mère étalon d’acides aminés (point 3.16.1). c = 2,5 μmol/ml de chacun dans l’acide chlorhydrique. S’obtient dans le commerce.

3.27.2.

Solution mère étalon d’acide cystéique et de méthionine sulfone, c = 1,25 μmol/ml. Dissoudre 0,2115 g d’acide cystéique (point 3.16.2) et 0,2265 g de méthionine sulfone (point 3.16.3) dans du tampon au citrate (point 3.24) dans une fiole jaugée de 1 litre et ajuster au trait de jauge avec du tampon au citrate. Conserver à une température inférieure à 5 °C pendant 12 mois au maximum. Cette solution n’est pas utilisée si la solution mère de l’étalon (point 3.27.1) contient de l’acide cystéique et de la méthionine sulfone.

3.27.3.

Solution de l’étalon interne, par exemple norleucine. c = 20 μmol/ml. Dissoudre 0,6560 g de norleucine (point 3.13) dans du tampon au citrate (point 3.24) dans une fiole jaugée et ajuster à 250 ml à l’aide du tampon au citrate. Conserver à une température inférieure à 5 °C pendant 6 mois au maximum.

3.27.4.

Solution d’étalonnage des acides aminés à utiliser avec des hydrolysats, c = 5 nmol/50 μl d’acide cystéique et de méthionine sulfone et c = 10 nmol/50 μl des autres acides aminés. Dissoudre 2,2 g de chlorure de sodium (point 3.10) dans un bécher de 100 ml avec 30 ml de tampon au citrate (point 3.24). Ajouter 4,00 ml de la solution étalon d’acides aminés (point 3.27.1), 4,00 ml de solution étalon d’acide cystéique et de méthionine de sulfone (point 3.27.2) et 0,50 ml de solution de l’étalon interne (point 3.27.3) le cas échéant. Ajuster le pH à 2,20 avec de l’hydroxyde de sodium (point 3.18). Transférer dans une fiole jaugée de 50 ml, ajuster au trait de jauge avec du tampon au citrate (point 3.24) et mélanger. Conserver à une température inférieure à 5 °C pendant 3 mois au maximum. Voir aussi les observations du point 9.1.

3.27.5.

Solution d’étalonnage des acides aminés à utiliser avec des hydrolysats préparés conformément au point 5.3.3.1 et destinés à être utilisés avec des extraits (point 5.2). Préparer la solution d’étalonnage conformément au point 3.27.4, mais sans chlorure de sodium. Conserver à une température inférieure à 5 °C pendant 3 mois au maximum.

4. Appareillage

4.1.

Ballon sphérique de 100 ou de 250 ml pourvu d’un réfrigérant à reflux.

4.2.

Flacon en verre de borosilicate de 100 ml avec bouchon à vis avec garniture de caoutchouc/téflon (par exemple Duran, Schott) pouvant être utilisé dans une étuve.

4.3.

Étuve à ventilation forcée et régulation de la température d’une précision supérieure à ± 2 °C.

4.4.

pH-mètre (à graduation à trois décimales).

4.5.

Filtre à membrane (0,22 μm).

4.6.

Centrifugeuse.

4.7.

Évaporateur rotatif sous vide.

4.8.

Agitateur mécanique ou magnétique.

4.9.

Analyseur d’acides aminés ou équipement pour CLHP avec colonne échangeuse d’ions, dispositif pour ninhydrine, dérivatisation postcolonne et détecteur photométrique. La colonne est remplie avec des résines de polystyrène sulfonées capables de séparer les différents acides aminés les uns des autres et d’autres produits réagissant à la ninhydrine. Le flux du tampon et du réactif de ninhydrine est assuré par des pompes dont le degré de stabilité du flux est de ± 0,5 % dans la période couvrant l’analyse de la solution d’étalonnage et l’analyse de l’échantillon. Avec certains analyseurs d’acides aminés, on peut utiliser des méthodes d’hydrolyse dans lesquelles l’hydrolysat a une concentration de sodium de c = 0,8 mol/l et contient tout l’acide formique résiduel provenant de l’oxydation. D’autres appareils ne donnent pas une séparation satisfaisante de certains acides aminés si l’hydrolysat contient trop d’acide formique et/ou présente des concentrations élevées d’ions sodium. Dans ce cas, le volume de l’acide est réduit par évaporation à environ 5 ml après l’hydrolyse et avant l’ajustement du pH. L’évaporation doit être faite sous vide à 40 °C au maximum.

5. Mode opératoire

5.1. Préparation de l’échantillon

Broyer l’échantillon pour le réduire à une granulométrie de 0,5 mm. Les échantillons à forte teneur en humidité doivent être desséchés à l’air à une température de 50 °C au maximum ou par lyophilisation avant broyage. Les échantillons à forte teneur en matières grasses doivent être extraits par l’éther de pétrole (point 3.12) avant broyage.

5.2. Dosage des acides aminés libres

Peser, à 0,2 mg près, une quantité adéquate (1-5 g) de l’échantillon préparé (point 5.1) dans un erlenmeyer et ajouter 100,0 ml du mélange d’extraction (point 3.21). Agiter le mélange pendant 60 min à l’aide d’un agitateur mécanique ou magnétique (point 4.8). Laisser décanter le sédiment et introduire à la pipette 10,0 ml de la solution surnageante dans un bécher de 100 ml.

Ajouter 5,0 ml de la solution d’acide sulfosalicylique (point 3.22) tout en remuant et poursuivre l’agitation pendant 5 min à l’aide de l’agitateur magnétique. Filtrer ou centrifuger la phase surnageante en vue d’en séparer le précipitat éventuel. Verser 10,0 ml de la solution obtenue dans un bécher de 100 ml, ajuster le pH à 2,20 à l’aide d’une solution d’hydroxyde de sodium (point 3.18), transférer le tout dans une fiole jaugée d’un volume approprié à l’aide du tampon au citrate (point 3.24) et ajuster au trait de jauge avec la solution tampon (point 3.24).

Si un étalon interne est utilisé, ajouter 1,00 ml de l’étalon interne (point 3.27.3) par fraction de 100 ml de la solution finale et ajuster au trait de jauge avec la solution tampon (point 3.24).

Passer à la chromatographie conformément au point 5.4.

Si les extraits ne sont pas chromatographiés le même jour, les conserver à une température inférieure à 5 °C.

5.3. Dosage des acides aminés totaux

5.3.1. Oxydation

Peser, à 0,2 mg près, entre 0,1 et 1 g de l’échantillon préparé (point 5.1) dans:

—	un ballon sphérique de 100 ml (point 4.1) pour hydrolyse ouverte (point 5.3.2.3), ou

—	un ballon sphérique de 250 ml (point 4.1) si l’on a besoin d’une faible concentration de sodium (point 5.3.3.1), ou

—	un flacon de 100 ml à bouchon à vis (point 4.2) (pour hydrolyse fermée point 5.3.2.4).

La portion d’échantillon pesée doit avoir une teneur en azote d’environ 10 mg et une teneur en humidité de 100 mg au plus.

Placer le ballon sphérique ou le flacon dans un bain d’eau glacée et refroidir à 0 °C; ajouter 5 ml du mélange à oxyder (point 3.23) et mélanger à l’aide d’une spatule de verre à bout courbé. Fermer hermétiquement le ballon/le flacon contenant la spatule à l’aide d’un film hermétique à l’air, placer le bain d’eau glacée avec le récipient ainsi fermé dans un réfrigérateur à 0 °C et l’y laisser séjourner pendant 16 heures. Enlever ensuite le produit du réfrigérateur et décomposer l’excès de réactif d’oxydation par addition de 0,84 g de disulfite de sodium (point 3.4).

Passer à l’opération du point 5.3.2.1.

5.3.2. Hydrolyse

5.3.2.1.

Hydrolyse des échantillons oxydés À l’échantillon oxydé préparé conformément au point 5.3.1, ajouter 25 ml du mélange d’hydrolyse (point 3.20) en prenant soin d’éliminer par rinçage tout résidu de l’échantillon adhérant aux parois du récipient et à la spatule. Selon la méthode d’hydrolyse utilisée, appliquer la méthode visée au point 5.3.2.3 ou 5.3.2.4.

5.3.2.2.

Hydrolyse des échantillons non oxydés Peser dans un ballon sphérique de 100 ml ou de 250 ml (point 4.1) ou dans un tube de 100 ml pourvu d’un bouchon à vis (point 4.2), à 0,2 mg près, de 0,1 à 1 g de l’échantillon préparé (point 5.1). La portion d’échantillon pesée doit avoir une teneur en azote d’environ 10 mg. Ajouter avec précaution 25 ml du mélange à hydrolyser (point 3.20) et mélanger avec l’échantillon. Procéder conformément au point 5.3.2.3 ou 5.3.2.4.

5.3.2.3.

Hydrolyse ouverte Ajouter 3 billes de verre au mélange contenu dans le ballon (préparé conformément au point 5.3.2.1 ou 5.3.2.2) et faire bouillir sous reflux en bouillonnement constant pendant 23 heures. Après l’hydrolyse, rincer le réfrigérant au moyen de 5 ml du tampon au citrate (point 3.24). Déconnecter le ballon et le faire refroidir dans un bain glacé. Poursuivre conformément au point 5.3.3.

5.3.2.4.

Hydrolyse fermée Placer le flacon contenant le mélange préparé conformément au point 5.3.2.1 ou 5.3.2.2 dans une étuve (point 4.3) chauffée à 110 °C. Pendant la première heure, placer le bouchon à vis sur le récipient de manière à éviter une élévation de la pression (due à l’évolution des substances gazeuses) et une explosion. Ne pas fermer le récipient en vissant le bouchon. Après 1 heure, fermer le récipient à l’aide du bouchon à vis et laisser reposer dans l’étuve (point 4.3) pendant 23 heures. Après l’hydrolyse, enlever le flacon de l’étuve, ouvrir avec précaution le bouchon et placer le flacon dans un bain d’eau glacée. Laisser refroidir. Selon la procédure adoptée pour l’ajustement du pH (point 5.3.3), transférer quantitativement le contenu du flacon dans un bécher de 250 ml ou dans un ballon sphérique de 250 ml à l’aide du tampon au citrate (point 3.24). Poursuivre conformément au point 5.3.3.

5.3.3. Ajustement du pH

En fonction de la tolérance en sodium de l’analyseur d’acides aminés (point 4.9), procéder conformément aux points 5.3.3.1 ou 5.3.3.2 pour l’ajustement du pH.

5.3.3.1.

Pour des systèmes chromatographiques (point 4.9) demandant une faible concentration de sodium Il est recommandé d’utiliser un étalon interne (point 3.27.3) si on utilise des analyseurs d’acides aminés demandant une faible concentration de sodium (lorsque le volume d’acide doit être réduit). Dans ce cas, ajouter 2,00 ml de la solution de l’étalon interne (point 3.27.3) à l’hydrolysat avant évaporation. Ajouter 2 gouttes de 1-Octanol (point 3.15) à l’hydrolysat obtenu conformément à la procédure du point 5.3.2.3 ou 5.3.2.4. À l’aide d’un évaporateur rotatif (point 4.7), réduire sous vide à 40 °C le volume à un niveau compris entre 5 et 10 ml. Si le volume est accidentellement réduit à moins de 5 ml, l’hydrolysat doit être rejeté et l’analyse recommencée. Ajuster le pH à 2,20 à l’aide d’une solution d’hydroxyde de sodium (point 3.18) et poursuivre conformément au point 5.3.4.

5.3.3.2.

Pour tous les autres analyseurs d’acides aminés (point 4.9) Recueillir les hydrolysats obtenus conformément au point 5.3.2.3 ou 5.3.2.4 et les neutraliser partiellement en ajoutant avec précaution, tout en agitant, 17 ml d’une solution d’hydroxyde de sodium (point 3.17), la température restant inférieure à 40 °C. L’ajustement du pH final à 2,20 s’effectue à température ambiante au moyen d’une solution d’hydroxyde de sodium conforme au point 3.17 et, enfin, d’une solution d’hydroxyde de sodium conforme au point 3.18. Poursuivre conformément au point 5.3.4.

5.3.4. Solution d’échantillon pour chromatographie

Transférer quantitativement l’hydrolysat à pH ajusté (point 5.3.3.1 ou 5.3.3.2) avec le tampon au citrate (point 3.24) dans une fiole jaugée de 200 ml et ajuster au trait de jauge à l’aide du tampon (point 3.24).

Si l’étalon interne (point 3.27.3) n’a pas encore été utilisé, en ajouter 2,00 ml et ajuster au trait de jauge avec du tampon au citrate (point 3.24). Mélanger soigneusement.

Poursuivre par la chromatographie (point 5.4).

Si les solutions des échantillons ne sont pas chromatographiées le même jour, les conserver à une température inférieure à 5 °C.

5.4. Chromatographie

Avant la chromatographie, porter l’extrait (point 5.2) ou l’hydrolysat (point 5.3.4) à température ambiante. Agiter le mélange et filtrer une partie appropriée à travers un filtre à membrane de 0,22 μm (point 4.5). La solution claire obtenue est soumise à une chromatographie par échange d’ions au moyen d’un analyseur d’acides aminés (point 4.9).

L’injection peut être opérée manuellement ou automatiquement. Il importe que la même quantité de solution (± 0,5 %) soit toujours ajoutée à la colonne pour l’analyse des étalons et des échantillons, sauf lorsqu’un étalon interne est utilisé, et que les rapports sodium/acide aminé dans les solutions étalons et les solutions des échantillons soient aussi identiques que possible.

En général, la fréquence des injections de la solution d’étalonnage dépend de la stabilité du réactif ninhydrine et du système d’analyse. La solution étalon ou d’échantillon est diluée avec un tampon au citrate (point 3.24) pour donner une surface de pic de la solution étalon de 30 à 200 % de la surface de pic de l’acide aminé dans l’échantillon.

La chromatographie des acides aminés varie légèrement selon le type d’analyseur employé et de résine utilisée. Le système retenu doit permettre de séparer les acides aminés les uns des autres et des substances réagissant à la ninhydrine. Au cours de l’opération, le système chromatographique doit donner une réponse linéaire à des variations des quantités d’acides aminés ajoutés dans la colonne.

Pendant la phase de chromatographie, les rapports de hauteur entre creux et sommets de pics mentionnés ci-dessous sont applicables lorsqu’une solution équimolaire des acides aminés est analysée. Cette solution équimolaire doit contenir au moins 30 % de la charge maximale de chaque acide aminé qui peut être déterminée avec précision à l’aide du système analyseur d’acides aminés (point 4.9).

Pour la séparation thréonine-sérine, le rapport de hauteur entre la vallée et le sommet du plus bas des deux acides aminés chevauchant, dans le chromatogramme, ne doit pas dépasser 2:10 [si le dosage porte seulement sur la cyst(é)ine, la méthionine, la thréonine et la lysine, une séparation insuffisante des pics voisins aura une influence défavorable sur le dosage]. Pour tous les autres acides aminés, la séparation doit être meilleure que 1:10.

Le système doit garantir que la lysine est séparée des “artefacts de lysine” et de l’ornithine.

6. Calcul des résultats

La surface des pics de l’échantillon et de la solution étalon est mesurée pour chaque acide aminé particulier et la quantité (X), exprimée en grammes d’acide aminé par kg d’échantillon, est calculée.

Si un étalon interne est utilisé, multiplier par:

A	=	surface de pic, hydrolysat ou extrait
B	=	surface de pic, solution d’étalonnage
C	=	surface de pic, étalon interne dans l’hydrolysat ou l’extrait
D	=	surface de pic, étalon interne, solution d’étalonnage
M	=	poids molaire de l’acide aminé dosé
c	=	concentration de l’étalon en μmol/ml
m	=	poids en grammes de l’échantillon (corrigé pour obtenir le poids initial si le produit est séché et/ou dégraissé)
V	=	ml d’hydrolysat total (point 5.3.4) ou ml du volume de l’extrait dilué total calculé (point 6.1)

La cystine et la cystéine sont dosées toutes deux sous forme d’acide cystéique dans les hydrolysats de l’échantillon oxydé mais calculées sous forme de cystine (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) en utilisant un M de 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

La méthionine est dosée sous forme de méthionine sulfone dans les hydrolysats de l’échantillon oxydé, mais calculée sous forme de méthionine en utilisant un M de 149,21 g/mol.

La méthionine libre ajoutée est dosée après extraction sous forme de méthionine; pour le calcul, appliquer la même valeur à M.

6.1.

Le volume de la dilution totale des extraits (F) pour le dosage des acides aminés libres (point 5.2) est calculé comme suit: V = volume de l’extrait final.

7. Évaluation de la méthode

La méthode a été testée dans une comparaison interlaboratoire internationale faite en 1990 sur la base de quatre aliments pour animaux différents (aliment composé pour porcs, aliment composé pour poulets de chair, concentré protéique, prémélange).

NB:

La méthode a été testée lors d’une deuxième comparaison interlaboratoire internationale faite en 2003 sur la base de pairs de doublets en aveugle d’échantillons d’aliments de finition et d’aliments de démarrage pour poulets de chair, de farine de poisson et de farine de volaille. Pour plus de détails, voir la norme EN ISO 13903.

La moyenne et l’écart type des résultats de la comparaison interlaboratoire de 1990, après élimination des aberrants, sont mentionnés dans les tableaux ci-après.

Moyennes en g/kg

Matériau de référence	Acide aminé
	Thréonine	Cyst(é)ine	Méthionine	Lysine
Aliment composé pour porcs	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Aliment composé pour poulets de chair	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Concentré protéique	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Prémélange	58,42 n = 16	—	90,21 n = 16	98,03 n = 16
n = nombre de laboratoires participants.

7.1. Répétabilité

La répétabilité, exprimée sous forme d’“écart type à l’intérieur du laboratoire” de la comparaison interlaboratoire du tableau précédent, est indiquée dans les tableaux ci-après.

Coefficient de variation (%) de la répétabilité (CVr)

Matériau de référence	Acide aminé
	Thréonine	Cyst(é)ine	Méthionine	Lysine
Aliment composé pour porcs	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Aliment composé pour poulets de chair	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Concentré protéique	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Prémélange	2,2 n = 16	-	2,4 n = 16	2,1 n = 16
n = nombre de laboratoires participants.

7.2. Reproductibilité

Les résultats relatifs à l’écart type entre laboratoires pour la comparaison interlaboratoire mentionnée ci-dessus figurent au tableau ci-dessous.

Coefficient de variation (%) de la reproductibilité (CVR)

Matériau de référence	Acide aminé
	Thréonine	Cyst(é)ine	Méthionine	Lysine
Aliment composé pour porcs	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Aliment composé pour poulets de chair	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Concentré protéique	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Prémélange	4,3 n = 16	—	6,9 n = 16	6,7 n = 16
n = nombre de laboratoires participants.

8. Utilisation de matériaux de référence

L’application correcte de la méthode est vérifiée par répétition des mesures des matériaux de référence certifiés éventuellement disponibles. L’étalonnage au moyen d’une solution d’étalonnage certifiée d’acides aminés est recommandée.

9. Observations

9.1.

Par suite des différences entre appareils analyseurs d’acides aminés, les concentrations finales des solutions d’étalonnage des acides aminés (voir les points 3.27.4 et 3.27.5) et de l’hydrolysat (voir le point 5.3.4) ont un caractère indicatif. Le champ de la réponse linéaire de l’appareillage doit être vérifié pour tous les acides aminés. La solution étalon est diluée avec un tampon au citrate pour donner des surfaces de pic se situant au milieu du champ.

9.2.

Dans les cas où un appareillage de chromatographie en phase liquide à haute performance est utilisé pour analyser les hydrolysats, les conditions d’essai doivent être optimisées conformément aux recommandations du fabricant.

9.3.

L’application de la méthode aux prémélanges ou aliments composés pour animaux contenant plus de 1 % de chlorure (concentré, aliments minéraux, aliments complémentaires) pourrait entraîner une sous-estimation de la méthionine, et un traitement spécial doit être prévu.

10. Critères de performance

La compilation des résultats (sauf pour la tyrosine) provenant des deux études collaboratives (de 1990, dont les résultats sont exposés ci-avant au point 7, et de 2005, dont les résultats sont exposés dans la norme ISO 13903). Les valeurs dérivées de ces deux essais interlaboratoires peuvent ne pas être applicables aux gammes de concentration et aux matrices autres que celles données.

10.1. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon dans le même laboratoire et par le même analyste ne doit pas dépasser:

—	6 % du résultat supérieur pour les acides aminés totaux dans le cas de la glycine, l’alanine, la lysine, la proline, l’acide glutamique, l’isoleucine et l’histidine,

—	8 % du résultat supérieur pour les acides aminés totaux dans le cas de la thréonine, la phénylalanine, la méthionine, l’acide aspartique et la leucine,

—	10 % du résultat supérieur pour les acides aminés totaux dans le cas de l’arginine et la valine,

—	12 % du résultat supérieur pour la sérine totale,

—	15 % du résultat supérieur pour la cyst(é)ine totale.

10.2. Reproductibilité

La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées sur le même échantillon dans des laboratoires différents et/ou par des opérateurs différents ne peut dépasser:

—	15 % du résultat supérieur pour les acides aminés totaux dans le cas de la glycine, l’alanine et la thréonine,

—	20 % du résultat supérieur pour les acides aminés totaux dans le cas de la lysine, la proline, la phénylalanine, la méthionine et l’acide aspartique,

—	22 % du résultat supérieur pour les acides aminés totaux dans le cas de l’acide glutamique et la leucine,

—	27 % du résultat supérieur pour l’arginine totale,

—	32 % du résultat supérieur pour l’isoleucine totale,

—	35 % du résultat supérieur pour les acides aminés totaux dans le cas de la valine et la serine,

—	40 % du résultat supérieur pour l’histidine totale,

—	50 % du résultat supérieur pour la cyst(é)ine totale.

F. DOSAGE DU TRYPTOPHANE

Les méthodes d’analyse à appliquer pour doser le tryptophane sont celles prévues par:

—	la norme EN ISO 13904 “Aliments des animaux — Dosage du tryptophane”,

—	la méthode d’analyse décrite aux points 1 à 9 ci-après.

1. Objet et champ d’application

La méthode permet de doser le tryptophane total et libre dans les aliments pour animaux. Elle ne fait pas de distinction entre les formes D et L.

2. Principe

Pour le dosage du tryptophane total, l’échantillon est hydrolysé en milieu basique avec une solution d’hydroxyde de baryum saturée et il est chauffé à 110 °C pendant 20 heures. Après l’hydrolyse, l’étalon interne est ajouté.

Pour le dosage du tryptophane libre, l’échantillon est extrait dans des conditions d’acidité modérée en présence de l’étalon interne.

Le tryptophane et l’étalon interne dans l’hydrolysat ou dans l’extrait sont dosés par CLHP à l’aide d’un détecteur fluorimétrique.

3. Réactifs

3.1.

Utiliser de l’eau bidistillée ou de l’eau de qualité équivalente (conductivité < 10 μS/cm).

3.2.

Substance étalon: tryptophane (pureté/teneur ≥ 99 %) séché sous vide sur pentoxyde de phosphore.

3.3.

Étalon interne: α-méthyl-tryptophane (pureté/teneur ≥ 99 %) séché sous vide sur pentoxyde de phosphore.

3.4.

Hydroxyde de baryum octahydraté (veiller à ne pas exposer excessivement le Ba(OH)2.8 H2O à l’air afin d’éviter la formation de BaCO3 qui pourrait perturber le dosage) (voir l’observation figurant au point 9.3).

3.5.

Hydroxyde de sodium.

3.6.

Acide orthophosphorique, p (p/p) = 85 %.

3.7.

Acide chlorhydrique, ρ20 1,19 g/ml.

3.8.

Méthanol, de qualité CLHP.

3.9.

Éther de pétrole, intervalle d’ébullition: 40-60 °C.

3.10.

Solution d’hydroxyde de sodium, c = 1 mol/l: dissoudre 40,0 g de NaOH (point 3.5) dans de l’eau et ajuster au litre avec de l’eau (point 3.1).

3.11.

Acide chlorhydrique, c = 6 mol/l: prendre 492 ml de HCl (point 3.7) et ajuster au litre avec de l’eau.

3.12.

Acide chlorhydrique, c = 1 mol/l: prendre 82 ml de HCl (point 3.7) et ajuster au litre avec de l’eau.

3.13.

Acide chlorhydrique, c = 0,1 mol/l: prendre 8,2 ml de HCl (point 3.7) et ajuster au litre avec de l’eau.

3.14.

Acide orthophosphorique, c = 0,5 mol/l: prendre 34 ml d’acide orthophosphorique (point 3.6) et ajuster au litre avec de l’eau (point 3.1).

3.15.

Solution concentrée de tryptophane (point 3.2), c = 2,50 μmol/ml: dans une fiole jaugée de 500 ml, dissoudre 0,2553 g de tryptophane (point 3.2) dans de l’acide chlorhydrique (point 3.13) et ajuster au trait de jauge avec de l’acide chlorhydrique (point 3.13). Conserver à – 18 °C pendant quatre semaines au maximum.

3.16.

Solution concentrée de l’étalon interne, c = 2,50 μmol/ml: dans une fiole jaugée de 500 ml, dissoudre 0,2728 g de α-méthyl-tryptophane (point 3.3) dans de l’acide chlorhydrique (point 3.13) et ajuster au trait de jauge avec de l’acide chlorhydrique (point 3.13). Conserver à – 18 °C pendant quatre semaines au maximum.

3.17.

Solution d’étalonnage de tryptophane et étalon interne: prendre 2,00 ml de solution concentrée de tryptophane (point 3.15) et 2,00 ml de solution concentrée de l’étalon interne (α-méthyl-tryptophane) (point 3.16). Diluer avec de l’eau (point 3.1) et du méthanol (point 3.8) approximativement au même volume et approximativement à la même concentration de méthanol (10-30 %) que l’hydrolysat fini. Cette solution doit être préparée peu avant d’être utilisée. Se protéger de la lumière directe du soleil pendant la préparation.

3.18.

Acide acétique.

3.19.

Trichloro-1,1,1-méthyl-2-propanol-2.

3.20.

Éthanolamine p (p/p) > 98 %.

3.21.

Solution de 1 g de trichloro-1,1,1-méthyl-2-propanol-2 (point 3.19) dans 100 ml de méthanol (point 3.8).

3.22.

Phase mobile pour CLHP: 3,00 g d’acide acétique (point 3.18) + 900 ml d’eau (point 3.1) + 50,0 ml de solution (point 3.21) de trichloro-1,1,1-méthyl-2-propanol-2 (point 3.19) dans du méthanol (point 3.8) (1 g/100 ml). Ajuster le pH à 5,00 à l’aide d’éthanolamine (point 3.20). Ajuster à 1 000 ml avec de l’eau (point 3.1).

4. Appareillage

4.1.

Équipement pour CLHP avec détection spectrofluorimétrique.

4.2.

Colonne de chromatographie liquide, 125 mm × 4 mm, C18, particules de 3 μm, ou équivalent.

4.3.

pH-mètre.

4.4.

Fiole en polypropylène, capacité 125 ml, à large col et bouchon à vis.

4.5.

Filtre à membrane de 0,45 μm.

4.6.

Autoclave, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar.

4.7.

Agitateur mécanique ou magnétique.

4.8.

Agitateur Vortex.

5. Mode opératoire

5.1. Préparation des échantillons

Broyer l’échantillon pour le réduire à une granulométrie de 0,5 mm. Les échantillons à forte teneur en humidité doivent être desséchés à l’air à une température de 50 °C au maximum ou par lyophilisation avant broyage. Les échantillons à forte teneur en matières grasses doivent être extraits par éther de pétrole (point 3.9) avant broyage.

5.2. Dosage du tryptophane libre (extrait)

Peser, à 1 mg près, une quantité adéquate (1-5 g) de l’échantillon préparé (point 5.1) dans une fiole erlenmeyer. Ajouter 100,0 ml d’acide chlorhydrique (point 3.13) et 5,00 ml de solution concentrée de l’étalon interne (point 3.16). Agiter ou mélanger pendant 60 minutes à l’aide d’un agitateur mécanique ou magnétique (point 4.7). Laisser décanter le sédiment et introduire à la pipette 10,0 ml de la solution surnageante dans un bécher. Ajouter 5 ml d’acide orthophosphorique (point 3.14). Ajuster le pH à 3 avec de l’hydroxyde de sodium (point 3.10). Ajouter suffisamment de méthanol (point 3.8) pour obtenir une concentration comprise entre 10 et 30 % de méthanol dans le volume final. Transférer dans une fiole jaugée de volume approprié et diluer avec de l’eau au volume nécessaire pour la chromatographie [environ le même volume que la solution étalon de calibration (point 3.17)].

Filtrer quelques millilitres de la solution au travers d’un filtre à membrane de 0,45 μm (point 4.5) avant d’injecter sur la colonne CLHP. Passer à la chromatographie conformément au point 5.4.

Protéger la solution étalon et les extraits de la lumière directe du soleil. Si les extraits ne peuvent pas être analysés le jour même, ils doivent être conservés à une température de 5 °C pendant trois jours au maximum.

5.3. Dosage du tryptophane total (hydrolysat)

Peser, à 0,2 mg près, entre 0,1 et 1 g de l’échantillon préparé (point 5.1) dans la fiole en polypropylène (point 4.4). La portion d’échantillon pesée doit avoir une teneur en azote d’environ 10 mg. Ajouter 8,4 g d’hydroxyde de baryum octahydraté (point 3.4) et 10 ml d’eau. Mélanger avec un agitateur Vortex (point 4.8) ou un agitateur magnétique (point 4.7). Laisser l’aimant enrobé de téflon dans le mélange. Laver les parois du récipient avec 4 ml d’eau. Poser le bouchon à vis et fermer la fiole sans serrer. Transférer dans un autoclave (point 4.6) avec de l’eau bouillante et maintenir en ébullition pendant 30 à 60 minutes. Fermer l’autoclave et le mettre en marche à 110 (± 2) °C pendant 20 heures.

Avant d’ouvrir l’autoclave, réduire la température à un peu moins de 100 °C. Pour éviter la cristallisation de Ba(OH)2.8 H2O, ajouter au mélange chaud 30 ml d’eau à la température ambiante. Agiter ou remuer doucement. Ajouter 2,00 ml de la solution concentrée de l’étalon interne (α-méthyl-tryptophane) (point 3.16). Refroidir les récipients dans un bain d’eau/de glace pendant 15 minutes.

Ajouter ensuite 5 ml d’acide orthophosphorique (point 3.14). Maintenir le récipient dans le bain réfrigérant et neutraliser au HCl (point 3.11) tout en remuant, puis ajuster le pH à 3,0 à l’aide de HCl (point 3.12). Ajouter suffisamment de méthanol pour obtenir une concentration comprise entre 10 et 30 % de méthanol dans le volume final. Transférer dans une fiole jaugée de volume approprié et diluer avec de l’eau au volume nécessaire pour la chromatographie (par exemple 100 ml). L’addition de méthanol ne doit pas provoquer de précipitation.

Filtrer quelques millilitres de la solution au travers d’un filtre à membrane de 0,45 μm (point 4.5) avant d’injecter sur la colonne CLHP. Passer à la chromatographie conformément au point 5.4.

Protéger la solution étalon et les hydrolysats de la lumière directe du soleil. Si les hydrolysats ne peuvent pas être analysés le jour même, ils doivent être conservés à une température de 5 °C pendant trois jours au maximum.

5.4. Dosage par CLHP

Les conditions suivantes de l’élution isocratique sont proposées à titre indicatif; d’autres conditions peuvent être appliquées, pourvu qu’elles donnent des résultats équivalents (voir également les observations figurant aux points 9.1 et 9.2):

Colonne de chromatographie liquide (point 4.2):	125 mm × 4 mm, C18, particules de 3 μm équivalent
Température de la colonne:	température ambiante
Phase mobile (point 3.22):	3,00 g d’acide acétique (point 3.18) + 900 ml d’eau (point 3.1) + 50,0 ml de solution (point 3.21) de trichloro-1,1,1-méthyl-2-propanol-2 (point 3.19) dans du méthanol (point 3.8).(1 g/100 ml). Ajuster le pH à 5,00 à l’aided’éthanolamine (point 3.20). Ajuster à 1 000 ml avec de l’eau (point 3.1).
Débit:	1 ml/min
Temps d’élution total:	environ 34 minutes
Longueur d’onde de détection:	(excitation: 280 nm, émission: 356 nm
Volume d’injection:	20 μl

6. Calcul des résultats

La quantité de tryptophane (X), exprimée en g par 100 g d’échantillon, est calculée.

A	=	surface du pic de l’étalon interne, solution étalon de calibration (point 3.17),
B	=	surface du pic de tryptophane, extrait (point 5.2) ou hydrolysat (point 5.3),
V1	=	volume en ml (2 ml) de solution concentrée de tryptophane (point 3.15) ajoutée à la solution d’étalonnage (point 3.17),
c	=	concentration en μmol/ml (= 2,50) de solution concentrée de tryptophane (point 3.15) ajoutée à la solution d’étalonnage (point 3.17),
V2	=	volume en ml de la solution concentrée de l’étalon interne (point 3.16) ajoutée à l’extraction (point 5.2) (= 5,00 ml) ou à l’hydrolysat (point 5.3) (= 2,00 ml),
C	=	surface du pic de l’étalon interne, extrait (point 5.2) ou hydrolysat (point 5.3),
D	=	surface du pic de tryptophane, solution étalon de calibration (point 3.17),
V3	=	volume en ml (= 2,00 ml) de la solution concentrée de l’étalon interne (point 3.16) ajoutée à la solution étalon de calibration (point 3.17),
m	=	poids de l’échantillon en g (corrigé pour obtenir le poids initial si le produit est séché et/ou dégraissé),
M	=	poids molaire du tryptophane (= 204,23 g/mol).

7. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur le même échantillon ne peut dépasser 10 % par rapport au résultat le plus élevé.

8. Résultats d’une étude collaborative

Une étude collaborative de l’UE (quatrième comparaison interlaboratoire) a été réalisée: douze laboratoires ont analysé trois échantillons pour certifier la méthode par hydrolyse. Chaque essai a été soumis à cinq analyses. Les résultats de l’étude figurent dans le tableau ci-après.

	Échantillon 1 Aliment pour porcs	Échantillon 2 Aliment pour porcs complété par du L-tryptophane	Échantillon 3 Aliment concentré pour porcs
L	12	12	12
n Moyenne [g/kg]	50 2,42	55 3,40	50 4,22
sr [g/kg]	0,05	0,05	0,08
r [g/kg]	0,14	0,14	0,22
CVr [%]	1,9	1,6	1,9
SR [g/kg]	0,15	0,20	0,09
R [g/kg]	0,42	0,56	0,25
CVR [%]	6,3	6,0	2,2
L = nombre de laboratoires ayant présenté des résultats n = nombre de résultats individuels retenus une fois les résultats aberrants éliminés (identifiés selon les tests de Cochran-Dixon) sr = écart type de répétabilité SR = écart type de reproductibilité r = répétabilité R = reproductibilité CVr = coefficient de variation de la répétabilité (%) CVR = coefficient de variation de la reproductibilité (%)

Une autre étude collaborative de l’UE (troisième comparaison interlaboratoire) a été réalisée: jusqu’à treize laboratoires ont analysé deux échantillons pour certifier la méthode par extraction du tryptophane libre. Chaque essai a été soumis à cinq analyses. Les résultats de l’étude figurent dans le tableau ci-après:

	Échantillon 4 Mélange de blé et de soja	Échantillon 5 Mélange de blé et de soja (= échantillon 4) avec addition de tryptophane (0,457 g/kg)
L n	12 55	12 60
Moyenne [g/kg]	0,391	0,931
sr [g/kg]	0,005	0,012
r [g/kg]	0,014	0,034
CVr [%]	1,34	1,34
SR [g/kg]	0,018	0,048
R [g/kg]	0,050	0,134
CVR [%]	4,71	5,11
L = nombre de laboratoires ayant présenté des résultats n = nombre de résultats individuels retenus une fois les résultats aberrants éliminés (identifiés selon les tests de Cochran-Dixon) sr = écart type de répétabilité SR = écart type de reproductibilité r = répétabilité R = reproductibilité CVr = coefficient de variation de la répétabilité (%) CVR = coefficient de variation de la reproductibilité (%)

Une autre étude interlaboratoire de l’UE a été réalisée: sept laboratoires ont analysé quatre échantillons pour certifier la méthode par hydrolyse. Chaque essai a été soumis à cinq analyses. Les résultats figurent dans le tableau suivant:

	Échantillon 1 Aliment composé pour porcs (CRM 117)	Échantillon 2 Farine de poisson à faible teneur en matières grasses (CRM 118)	Échantillon 3 Farine de soja (CRM 119)	Échantillon 4 Lait écrémé en poudre (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Moyenne [g/kg]	2,064	8,801	6,882	5,236
sr [g/kg]	0,021	0,101	0,089	0,040
r [g/kg]	0,059	0,283	0,249	0,112
CVr [%]	1,04	1,15	1,30	0,76
SR [g/kg]	0,031	0,413	0,283	0,221
R [g/kg]	0,087	1,156	0,792	0,619
CVR [%]	1,48	4,69	4,11	4,22
L = nombre de laboratoires ayant présenté des résultats n = nombre de résultats individuels retenus une fois les résultats aberrants éliminés (identifiés selon les tests de Cochran-Dixon) sr = écart type de répétabilité SR = écart type de reproductibilité r = répétabilité R = reproductibilité CVr = coefficient de variation de la répétabilité (%) CVR = coefficient de variation de la reproductibilité (%)

9. Observations

9.1.

Les conditions de chromatographie spéciales suivantes peuvent donner une meilleure séparation entre le tryptophane et le α-méthyl-tryptophane. Élution isocratique suivie d’un nettoyage de la colonne par gradient: Colonne de chromatographie liquide: 125 mm × 4 mm, C18, particules de 5 μm, ou équivalent Température de la colonne: 32 °C Phase mobile: A: 0,01 mol/l KH2PO4/méthanol, 95 + 5 (V + V). B: Méthanol. Programme du gradient: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Débit: 1,2 ml/min Temps d’élution total: environ 33 minutes

9.2.

La chromatographie varie selon le type de CLHP et selon le remplissage de la colonne. Le système retenu doit donner un retour à la ligne de base entre les pics du tryptophane et de l’étalon interne. De plus, il est important que les produits de décomposition soient bien séparés du tryptophane et de l’étalon interne. Il faut réaliser un essai sans étalon interne de façon à vérifier l’absence d’impuretés sur la ligne de base au niveau de l’étalon interne. Il est important que le temps d’élution soit suffisamment long pour permettre l’élution de tous les produits de décomposition, faute de quoi des pics d’élution tardifs peuvent interférer avec les opérations de chromatographie ultérieures. Dans la gamme des opérations, le système chromatographique doit donner une réponse linéaire. Cette réponse doit être mesurée à une concentration constante (la concentration normale) de l’étalon interne et à différentes concentrations de tryptophane. Il est important que la hauteur des pics du tryptophane et de l’étalon interne se situe dans la gamme linéaire du système CLHP/fluorescence. Si le ou les pics du tryptophane et/ou de l’étalon interne sont trop petits ou trop grands, l’analyse doit être répétée avec un échantillon d’une autre dimension et/ou un volume final modifié.

9.3. Hydroxyde de baryum

Avec le temps, l’hydroxyde de baryum devient plus difficile à dissoudre. Cela donne une solution trouble pour le dosage par CLHP, ce qui peut entraîner de faibles résultats pour le tryptophane.

G. DOSAGE DES MATIÈRES GRASSES BRUTES

1. Objet et champ d’application

La méthode est destinée à déterminer la teneur en matières grasses brutes des aliments pour animaux.

L’application des deux procédés décrits ci-après dépend de la nature et de la composition des aliments pour animaux et de la raison pour laquelle l’analyse est effectuée.

Pour le dosage des matières grasses brutes dans les graines et fruits oléagineux ainsi que dans les aliments pour animaux dont la teneur en matières grasses brutes est supérieure à 15 %, l’extraction doit se faire selon la procédure A et la deuxième extraction selon la procédure B (point 5.3).

1.1. Procédé A — Matières grasses directement extractibles

Ce procédé est applicable aux matières premières pour aliments des animaux d’origine végétale, à l’exception de celles auxquelles s’applique le procédé B.

1.2. Procédé B — Matières grasses brutes totales

Ce procédé est applicable aux matières premières pour aliments des animaux d’origine animale et à tous les aliments composés. Il doit être utilisé pour toutes les matières premières dont les matières grasses ne sont pas complètement extractibles sans hydrolyse préalable, par exemple le gluten, les levures, les protéines de pomme de terre et les produits soumis à des procédés tels que l’extrusion, la floconnisation et le chauffage.

1.3. Interprétation des résultats

Dans tous les cas où l’application du procédé B donne un résultat supérieur à celui obtenu grâce à l’application du procédé A, le résultat obtenu au moyen du procédé B est accepté comme valeur réelle.

2. Principe

2.1. Procédé A

L’échantillon est extrait par de l’éther de pétrole. Le solvant est éliminé par distillation et le résidu est séché et pesé.

2.2. Procédé B

L’échantillon est traité à chaud par de l’acide chlorhydrique. Le mélange est refroidi et filtré. Après avoir été lavé et séché, le résidu est soumis à l’analyse selon le procédé A.

3. Réactifs

3.1.

Éther de pétrole, intervalle d’ébullition: 40 à 60 °C. L’indice de brome doit être inférieur à 1 et le résidu après évaporation inférieur à 2 mg/100 ml.

3.2.

Sulfate de sodium, anhydre.

3.3.

Acide chlorhydrique, c = 3mol/l.

3.4.

Adjuvant de filtration, par exemple terre de diatomées, Hyflo-supercel.

4. Appareillage

4.1.

Extracteur. Si l’appareil est muni d’un siphon (appareil de Soxhlet), le débit du reflux doit être réglé de façon à obtenir environ dix cycles par heure; s’il s’agit d’un appareil sans siphon, le débit de liquide reflué doit être de 10 ml environ par minute.

4.2.

Cartouches d’extraction, exemptes de matière soluble dans l’éther de pétrole, dont la porosité est compatible avec les exigences du point 4.1.

4.3.

Étuve à dessication, soit par le vide à 75 °C ± 3 °C, soit à pression atmosphérique à 100 °C ± 3 °C.

5. Mode opératoire

5.1. Procédé A (voir le point 8.1)

Peser, à 1 mg près, 5 g de l’échantillon, les introduire dans une cartouche d’extraction (point 4.2) et les recouvrir d’un tampon de coton dégraissé.

Placer la cartouche dans un extracteur (point 4.1) et extraire durant 6 heures par de l’éther de pétrole (point 3.1). Recueillir l’extrait dans une fiole sèche, tarée et contenant des fragments de pierre ponce (6).

Éliminer le solvant par distillation. Sécher le résidu en plaçant la fiole pendant une heure et demie dans l’étuve à dessiccation (point 4.3). Laisser refroidir dans un dessiccateur et peser. Sécher de nouveau pendant 30 minutes pour s’assurer que le poids des matières grasses reste constant (la perte de poids entre deux pesées successives doit être inférieure à 1 mg).

5.2. Procédé B

Peser, à 1 mg près, 2,5 g de l’échantillon (voir le point 8.2), les introduire dans un bécher de 400 ml ou une fiole conique de 300 ml et ajouter 100 ml d’acide chlorhydrique (point 3.3) et des fragments de pierre ponce. Recouvrir le bécher d’un verre de montre ou munir la fiole conique d’un réfrigérant à reflux. Amener le mélange à ébullition douce, à l’aide d’une petite flamme ou d’une plaque chauffante, et l’y maintenir durant une heure. Éviter que le produit adhère aux parois du récipient.

Refroidir et ajouter une quantité d’adjuvant de filtration (point 3.4) suffisante pour éviter toute perte de matières grasses lors de la filtration. Filtrer sur un double papier filtre mouillé, exempt de matières grasses. Laver le résidu à l’eau froide jusqu’à neutralité du filtrat. Vérifier que le filtrat ne contient pas de matières grasses. La présence de celles-ci indique qu’une extraction de l’échantillon par l’éther de pétrole, selon le procédé A, doit être effectuée préalablement à l’hydrolyse.

Placer le double papier filtre contenant le résidu sur un verre de montre et sécher durant une heure et demie dans l’étuve à pression atmosphérique (point 4.3) à 100 °C ± 3 °C.

Introduire le double papier filtre contenant le résidu sec dans une cartouche à extraction (point 4.2) et le recouvrir d’un tampon de coton dégraissé. Placer la cartouche dans un extracteur (point 4.1) et poursuivre le mode opératoire comme indiqué au point 5.1, deuxième et troisième alinéas.

5.3. Procédé A et deuxième extraction selon le procédé B

Pour le dosage des matières grasses brutes dans les graines et fruits oléagineux ainsi que dans les aliments pour animaux dont la teneur en matières grasses brutes est supérieure à 15 %, l’extraction doit se faire selon le procédé A et la deuxième extraction selon le procédé B.

Cela signifie qu’après l’extraction par de l’éther de pétrole (procédé A), le résidu ou une portion du résidu est de nouveau extrait au moyen d’acide chlorhydrique procédé B) La teneur en matières grasses brutes correspond à la somme des résultats des procédés A et B.

6. Expression du résultat

Exprimer le poids du résidu sous forme de pourcentage de l’échantillon.

7. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur un même échantillon par le même analyste ne peut dépasser:

—	0,2 %, en valeur absolue, pour les teneurs en matières grasses brutes inférieures à 5 %,

—	4,0 % du résultat le plus élevé pour les teneurs de 5 à 10 %,

—	0,4 %, en valeur absolue, pour les teneurs supérieures à 10 %.

8. Observations

8.1.

Pour les produits à teneur élevée en matières grasses qui sont difficiles à broyer ou non appropriés au prélèvement d’une prise d’essai réduite homogène, procéder de la manière suivante. Peser, à 1 mg près, 20 g de l’échantillon et les mélanger à 10 g ou plus de sulfate de sodium anhydre (point 3.2). Extraire par l’éther de pétrole (point 3.1) comme indiqué au point 5.1. Ajuster l’extrait obtenu à 500 ml avec de l’éther de pétrole (point 3.1) et mélanger. Introduire 50 ml de la solution dans une petite fiole sèche, tarée et contenant des fragments de pierre ponce. Éliminer le solvant par distillation, sécher et poursuivre le mode opératoire comme indiqué au point 5.1, dernier alinéa. Éliminer le solvant du résidu d’extraction se trouvant dans la cartouche, broyer le résidu à la finesse de 1 mm, le replacer dans la cartouche (ne pas ajouter de sulfate de sodium) et poursuivre le mode opératoire comme indiqué au point 5.1, deuxième et troisième alinéas. Calculer la teneur en matières grasses, exprimée en pourcentage de l’échantillon, au moyen de la formule suivante: où: m1 = poids, en grammes, du résidu de la première extraction (partie aliquote de l’extrait), m2 = poids, en grammes, du résidu de la seconde extraction.

8.2.

La prise d’essai de certains produits (p.ex. les produits pauvres en matières grasses) peut être augmentée.

8.3.

Les aliments pour animaux de compagnie ayant une teneur élevée en eau peuvent devoir être mélangés avec du sulfate de sodium anhydre préalablement à l’hydrolyse et à l’extraction selon le procédé B.

8.4.

Au point 5.2, il peut être plus efficace d’utiliser de l’eau chaude au lieu de l’eau froide pour laver le résidu après filtration.

8.5.

Il se peut que le temps de séchage (1 h 30) doive être allongé pour certains aliments pour animaux. Un temps de séchage excessif doit être évité dans la mesure où il peut donner de faibles résultats. Un four à micro-ondes peut également être utilisé.

H. DOSAGE DE LA CELLULOSE BRUTE

1. Objet et champ d’application

La méthode permet de doser, dans les aliments pour animaux, les matières organiques exemptes de graisses et insolubles en milieu acide et en milieu alcalin, conventionnellement désignées sous le nom de cellulose brute.

La méthode n’est pas applicable dans le cas de la lignocellulose et du carbone végétal (particules trop fines).

2. Principe

L’échantillon, dégraissé si nécessaire, est traité successivement par des solutions bouillantes d’acide sulfurique et d’hydroxyde de potassium de concentrations déterminées. Le résidu est séparé par filtration sur un filtre en verre fritté, lavé, séché, pesé puis incinéré entre 475 et 500 °C. La perte de poids résultant de l’incinération correspond à la cellulose brute de la prise d’essai.

3. Réactifs

3.1.

Acide sulfurique, c = 0,13 mol/l.

3.2.

Antimousse (n-octanol, par exemple).

3.3.

Adjuvant de filtration (Celite 545 ou équivalent) chauffé à 500 °C pendant 4 heures (point 8.6).

3.4.

Acétone.

3.5.

Éther de pétrole, intervalle d’ébullition: 40-60 °C.

3.6.

Acide chlorhydrique, c = 0,5 mol/l.

3.7.

Solution d’hydroxyde de potassium, c = 0,23 mol/l.

4. Appareillage

4.1.

Unité de chauffage pour la digestion par des solutions d’acide sulfurique ou d’hydroxyde de potassium. Cette unité est munie d’un support à creuset filtrant (point 4.2) et pourvue d’un tuyau avec vanne vers le vide et la vidange. Elle est éventuellement pourvue d’air comprimé. Avant chaque utilisation journalière, préchauffer l’unité avec de l’eau bouillante pendant 5 minutes.

4.2.

Creuset filtrant en verre muni d’un filtre en verre fritté de porosité 40-90 μm. Avant la première utilisation, chauffer à 500 °C pendant quelques minutes et refroidir (point 8.6).

4.3.

Cylindre d’au moins 270 ml avec un réfrigérant à reflux, approprié à l’ébullition.

4.4.

Étuve avec thermostat.

4.5.

Four à moufle avec thermostat.

4.6.

Unité d’extraction comprenant un support pour le creuset filtrant (point 4.2) et un tuyau d’évacuation avec vanne vers le vide et la vidange.

4.7.

Joints pour assembler l’unité de chauffage (point 4.1), le creuset (point 4.2) et le cylindre (point 4.3), et pour connecter l’unité d’extraction (point 4.6) à froid et le creuset.

5. Mode opératoire

Peser, à 1 mg près, 1 g de l’échantillon préparé, le mettre dans le creuset (point 4.2) (voir observations points 9.1, 9.2, 9.3) et ajouter 1 g d’adjuvant de filtration (point 3.3).

Assembler l’unité de chauffage (point 4.1) et le creuset filtrant (point 4.2), puis attacher le cylindre (point 4.3) au creuset. Remplir de 150 ml d’acide sulfurique bouillant (point 3.1) l’ensemble cylindre-creuset et, si nécessaire, ajouter quelques gouttes d’antimousse (point 3.2).

Porter le liquide à ébullition en 5 ± 2 minutes et bouillir vivement pendant 30 minutes exactement.

Positionner la vanne vers le tuyau de vidange (point 4.1) et, sous vide, filtrer l’acide sulfurique à travers le creuset filtrant et laver le résidu avec trois fois 30 ml d’eau bouillante, en veillant à ce que le résidu aille à sec après chaque lavage.

Fermer la vanne de vidange et verser 150 ml de solution bouillante d’hydroxyde de potassium (point 3.7) dans l’ensemble cylindre-creuset et ajouter quelques gouttes d’antimousse (point 3.2). Porter le liquide à ébullition en 5 ± 2 minutes et bouillir vivement pendant exactement 30 minutes. Filtrer et répéter la procédure de lavage comme pour l’acide sulfurique.

Après le lavage final et le séchage, disjoindre le creuset et son contenu et le reconnecter à l’unité d’extraction à froid (point 4.6). Mettre le vide et laver le résidu dans le creuset avec trois portions successives de 25 ml d’acétone (point 3.4) en veillant à ce que le résidu aille à sec après chaque lavage.

Sécher le creuset jusqu’à poids constant à l’étuve à 130 °C. Après chaque séchage, refroidir dans le dessiccateur et peser rapidement. Placer le creuset dans un four à moufle et incinérer jusqu’à poids constant (la perte de poids entre deux pesées successives doit être inférieure ou égale à 2 mg) entre 475 et 500 °C pendant au moins 30 minutes.

Après chaque chauffage, refroidir d’abord dans le four puis dans le dessiccateur avant de peser.

Effectuer un essai à blanc sans l’échantillon. La perte de poids résultant de l’incinération ne peut excéder 4 mg.

6. Calcul des résultats

La teneur en cellulose brute exprimée sous forme de pourcentage de l’échantillon est donnée par la formule suivante:

où:

m	=	poids de l’échantillon (en g);
m0	=	perte de poids (en g) après incinération, lors du dosage;
m1	=	perte de poids (en g) après incinération, lors de l’essai à blanc.

7. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur le même échantillon ne peut dépasser:

—	0,6 % en valeur absolue, pour les teneurs en cellulose brute inférieures à 10 %,

—	6 % par rapport au résultat le plus élevé, pour les teneurs en cellulose brute égales ou supérieures à 10 %.

8. Reproductibilité

La différence entre les résultats de deux dosages effectués sur le même échantillon dans des laboratoires différents ne peut dépasser:

—	1,0 % en valeur absolue, pour les teneurs en cellulose brute inférieures à 10 %,

—	10 % par rapport au résultat le plus élevé, pour les teneurs en cellulose brute égales ou supérieures à 10 %.

9. Observations

9.1.

Les aliments pour animaux contenant plus de 10 % de matières grasses brutes doivent être dégraissés avant l’analyse au moyen d’éther de pétrole (point 3.5). Connecter le creuset filtrant (point 4.2) et son contenu à l’unité d’extraction à froid (point 4.6), appliquer le vide et laver le résidu avec trois fois 30 ml d’éther de pétrole. S’assurer que le résidu est sec. Connecter le creuset et son contenu à l’unité de chauffage (point 4.1) et continuer comme décrit au point 5.

9.2.

Les aliments pour animaux contenant des matières grasses qui ne peuvent être directement extraites par l’éther de pétrole (point 3.5) doivent être dégraissés comme indiqué au point 8.1 et dégraissés de nouveau après ébullition avec l’acide. Après l’ébullition avec l’acide et les lavages qui suivent, connecter le creuset et son contenu à l’unité d’extraction à froid (point 4.6) et laver trois fois avec 30 ml d’acétone et ensuite trois fois avec 30 ml d’éther de pétrole. Filtrer sous vide jusqu’au séchage et continuer l’analyse telle qu’elle est décrite au point 5 en commençant au niveau du traitement par l’hydroxyde de potassium.

9.3.

Si l’aliment pour animaux contient plus de 5 % de carbonates, exprimés en carbonate de calcium, connecter le creuset (point 4.2) avec l’échantillon pesé à l’unité de chauffage (point 4.1). Laver l’échantillon avec trois fois 30 ml d’acide chlorhydrique (point 3.6). Après chaque addition, attendre environ 1 minute avant de filtrer. Laver une fois avec 30 ml d’eau et continuer ensuite comme décrit au point 5.

9.4.

Si un appareil en forme de dressoir est utilisé (plusieurs creusets attachés à la même unité de chauffage), ne pas effectuer deux essais du même échantillon dans la même série.

9.5.

Si, après ébullition, il est difficile de filtrer les solutions acide et basique, utiliser l’air comprimé par le tuyau de vidange de l’unité de chauffage, puis continuer la filtration.

9.6.

Il convient que la température d’incinération ne dépasse pas 500 °C, de façon à allonger la durée de vie des creusets filtrants en verre. Prendre soin d’éviter les chocs thermiques excessifs pendant les cycles de chauffage et de refroidissement.

I. DOSAGE DES SUCRES

1. Objet et champ d’application

La méthode permet de doser les sucres réducteurs et les sucres totaux après inversion, exprimés en glucose ou, le cas échéant, en saccharose, par conversion à l’aide du facteur 0,95. Elle est applicable aux aliments composés. Des modalités particulières sont prévues pour d’autres aliments. Il convient, si nécessaire, de doser séparément le lactose et d’en tenir compte dans le calcul des résultats.

La méthode doit servir à déterminer la teneur en sucres aux fins du calcul de la valeur énergétique des aliments pour animaux.

D’autres méthodes d’analyse peuvent être utilisées lorsque la teneur en sucres doit être déterminée à d’autres fins.

2. Principe

Les sucres sont dissous dans l’éthanol dilué; la solution est déféquée au moyen des solutions de Carrez I et II. Après élimination de l’éthanol, les dosages sont effectués avant et après inversion, selon la méthode de Luff-Schoorl.

3. Réactifs

3.1.

Solution d’éthanol à 40 % (v/v), densité: 0,948 g/ml à 20 °C, amené au point de virage de la phénolphtaléine.

3.2.

Solution de Carrez I: dissoudre dans l’eau 21,9 g d’acétate de zinc Zn(CH3 COO)2 2H2O et 3 g d’acide acétique glacial. Ajuster à 100 ml avec de l’eau.

3.3.

Solution de Carrez II: dissoudre dans l’eau 10,6 g de ferrocyanure de potassium K4Fe(CN)6 3H2O. Ajuster à 100 ml avec de l’eau.

3.4.

Solution à 0,1 % (p/v) de méthylorange.

3.5.

Acide chlorhydrique à 4 mol/l.

3.6.

Acide chlorhydrique à 0,1 mol/l.

3.7.

Solution d’hydroxyde de sodium 0,1 mol/l.

3.8.

Réactif selon Luff-Schoorl: Verser, tout en agitant prudemment, la solution d’acide citrique (point 3.8.2) dans la solution de carbonate de sodium (point 3.8.3). Ajouter ensuite la solution de sulfate de cuivre (point 3.8.1) et ajuster à 1 litre avec de l’eau. Laisser reposer une nuit et filtrer. Contrôler la concentration du réactif ainsi obtenu (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l), voir le point 5.4, dernier alinéa. Le pH de la solution doit être de 9,4 environ.

3.8.1.

Solution de sulfate de cuivre: dissoudre 25 g de sulfate de cuivre Cu SO4 5H2O, exempt de fer, dans 100 ml d’eau.

3.8.2.

Solution d’acide citrique: dissoudre 50 g d’acide citrique, C6H8O7•H2O dans 50 ml d’eau.

3.8.3.

Solution de carbonate de sodium: dissoudre 143,8 g de carbonate de sodium anhydre dans environ 300 ml d’eau chaude. Laisser refroidir.

3.9.

Solution de thiosulfate de sodium 0,1 mol/l.

3.10.

Solution d’amidon: ajouter un mélange de 5 g d’amidon soluble dans 30 ml d’eau à 1 litre d’eau bouillante. Faire bouillir durant 3 minutes, laisser refroidir, ajouter au besoin 10 mg d’iodure mercurique comme agent conservateur.

3.11.

Acide sulfurique 3 mol/l.

3.12.

Solution à 30 % (p/v) d’iodure de potassium.

3.13.

Granulés de pierre ponce bouillis dans l’acide chlorhydrique, lavés à l’eau et séchés.

3.14.

3-méthylbutan-1-ol.

4. Appareillage

Mélangeur (culbuteur): environ 35 à 40 retournements par minute.

5. Mode opératoire

5.1. Mise en solution

Peser, à 1 mg près, 2,5 g de l’échantillon et les introduire dans une fiole jaugée de 250 ml. Ajouter 200 ml d’éthanol (point 3.1) et mélanger pendant une heure dans le culbuteur. Ajouter 5 ml de solution de Carrez I (point 3.2) et agiter pendant environ 30 secondes. Ajouter 5 ml de solution de Carrez II (point 3.3) et agiter de nouveau pendant 1 minute. Ajuster au trait de jauge avec de l’éthanol (point 3.1), homogénéiser et filtrer. Prélever 200 ml du filtrat et évaporer environ la moitié du volume de manière à éliminer la majeure partie de l’éthanol. Transvaser quantitativement le résidu d’évaporation, à l’aide d’eau chaude, dans une fiole jaugée de 200 ml, refroidir, ajuster au trait de jauge avec de l’eau, homogénéiser et filtrer, si nécessaire. Cette solution sera utilisée pour le dosage des sucres réducteurs et, après inversion, pour le dosage des sucres totaux.

5.2. Dosage des sucres réducteurs

Prélever à la pipette une quantité de solution n’excédant pas 25 ml et contenant moins de 60 mg de sucres réducteurs, exprimés en glucose. Si nécessaire, ajuster à 25 ml avec de l’eau distillée et déterminer la teneur en sucres réducteurs au moyen de la méthode de Luff-Schoorl. Le résultat est exprimé sous forme de pourcentage de glucose dans l’échantillon.

5.3. Dosage des sucres totaux après inversion

Prélever à la pipette 50 ml de solution et les porter dans une fiole jaugée de 100 ml. Ajouter quelques gouttes de solution de méthylorange (point 3.4), puis, prudemment et tout en agitant, de l’acide chlorhydrique (point 3.5) jusqu’à virage net au rouge. Ajouter 15 ml d’acide chlorhydrique (point 3.6), plonger la fiole dans un bain d’eau à forte ébullition et l’y maintenir durant 30 minutes. Refroidir rapidement à 20 °C environ et ajouter 15 ml de solution d’hydroxyde de sodium (point 3.7). Ajuster à 100 ml avec de l’eau et homogénéiser. Prélever une quantité n’excédant pas 25 ml et contenant moins de 60 mg de sucres réducteurs, exprimés en glucose. Si nécessaire, ajuster à 25 ml avec de l’eau distillée et déterminer la teneur en sucres réducteurs au moyen de la méthode de Luff-Schoorl. Le résultat est exprimé sous forme de pourcentage de glucose ou, le cas échéant, de saccharose, en multipliant par le facteur 0,95.

5.4. Titrage selon la méthode de Luff-Schoorl

Prélever à la pipette 25 ml du réactif selon Luff-Schoorl (point 3.8) et les porter dans un erlenmeyer de 300 ml; ajouter 25 ml, exactement mesurés, de la solution déféquée de sucres. Ajouter deux granulés de pierre ponce (point 3.13), chauffer, en agitant à la main, sur une flamme libre de hauteur moyenne et porter le liquide à ébullition en 2 minutes environ. Placer immédiatement l’erlenmeyer sur une toile métallique pourvue d’un écran d’amiante muni d’un trou de 6 cm environ de diamètre, sous laquelle on a préalablement allumé une flamme. Celle-ci est réglée de façon que seul le fond de l’erlenmeyer soit chauffé. Adapter ensuite un réfrigérant à reflux sur l’erlenmeyer. À partir de ce moment, faire bouillir pendant 10 minutes exactement. Refroidir immédiatement dans l’eau froide et après 5 minutes environ, titrer comme suit:

Ajouter 10 ml de solution d’iodure de potassium (point 3.12) et, immédiatement après et avec prudence (en raison du risque de formation d’une mousse abondante), 25 ml d’acide sulfurique (point 3.11). Titrer ensuite par la solution de thiosulfate de sodium (point 3.9) jusqu’à apparition d’une coloration jaune terne, ajouter l’indicateur à l’amidon (point 3.10) et achever le titrage.

Effectuer le même titrage sur un mélange exactement mesuré de 25 ml de réactif selon Luff-Schoorl (point 3.8) et 25 ml d’eau, après avoir ajouté 10 ml de solution d’iodure de potassium (point 3.12) et 25 ml d’acide sulfurique (point 3.11), sans porter à ébullition.

6. Calcul des résultats

Déterminer, à l’aide de la table, la quantité de glucose (en mg) qui correspond à la différence entre les valeurs des deux titrages, exprimées en ml de thiosulfate de sodium 0,1 mol/l. Exprimer le résultat sous forme de pourcentage de l’échantillon.

7. Modes opératoires particuliers

7.1.

Pour les aliments très riches en mélasse et d’autres aliments peu homogènes, peser 20 g et les introduire dans une fiole jaugée de 1 litre avec 500 ml d’eau. Mélanger pendant une heure dans le culbuteur. Déféquer au moyen des réactifs que sont les solutions de Carrez I (point 3.2) et II (point 3.3) comme décrit au point 5.1 en utilisant, toutefois, une quantité quatre fois plus élevée de chaque réactif. Ajuster au trait de jauge avec de l’éthanol à 80 % (v/v). Homogénéiser et filtrer. Éliminer l’éthanol comme décrit au point 5.1. En l’absence d’amidon dextrinisé, ajuster au trait de jauge avec de l’eau distillée.

7.2.

Pour les mélasses et les matières premières pour aliments des animaux riches en sucres et presque exempts d’amidon (caroubes, cossettes séchées de betteraves, etc.), peser 5 g, les introduire dans une fiole jaugée de 250 ml, ajouter 200 ml d’eau distillée et mélanger pendant une heure, ou plus si nécessaire, dans le culbuteur. Déféquer ensuite au moyen des réactifs que sont les solutions de Carrez I (point 3.2) et II (point 3.3), comme décrit au point 5.1. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau froide, homogénéiser et filtrer. Pour doser les sucres totaux, poursuivre comme décrit au point 5.3.

8. Observations

8.1.

Il est recommandé d’ajouter environ 1 ml de 3-méthylbutan-1-ol (point 3.14) (sans tenir compte du volume), avant l’ébullition avec le réactif de Luff-Schoorl, afin d’éviter la formation de mousse.

8.2.

La différence entre la teneur en sucres totaux après inversion, exprimés en glucose, et la teneur en sucres réducteurs, exprimés en glucose, multipliée par 0,95, donne la teneur en saccharose pour cent.

8.3.

Pour déterminer la teneur en sucres réducteurs, à l’exclusion du lactose, deux voies peuvent être adoptées.

8.3.1.

Pour un calcul approximatif, on multiplie par 0,675 la teneur en lactose déterminée par une méthode d’analyse différente et on retranche le résultat obtenu de la teneur en sucres réducteurs.

8.3.2.

Pour un calcul précis des sucres réducteurs, à l’exclusion du lactose, il est nécessaire de partir du même échantillon pour les deux dosages finals. L’une des analyses est effectuée sur une partie de la solution obtenue en application du point 5.1, l’autre sur une partie de la solution obtenue lors du dosage du lactose selon la méthode prévue à cet effet (après fermentation des autres espèces de sucres et défécation). Dans les deux cas, la quantité de sucre présente est déterminée selon la méthode de Luff-Schoorl et calculée en mg de glucose. L’une des deux valeurs est retranchée de l’autre et la différence est exprimée en pourcentage de l’échantillon. Exemple Les deux volumes prélevés correspondent, pour chaque dosage, à un échantillon de 250 mg. On consomme 17 ml de solution de thiosulfate de sodium 0,1 mol/l, ce qui correspond à 44,2 mg de glucose, dans le premier cas, et 11 ml de la solution, ce qui correspond à 27,6 mg de glucose, dans le second cas. La différence s’élève à 16,6 mg de glucose. La teneur en sucres réducteurs (lactose excepté), calculée en glucose est donc de: Table des valeurs pour 25 ml de réactif selon Luff-Schoorl ml de Na2 S2 O3 0,1 mol/l, 2 minutes de chauffage, 10 minutes d’ébullition Na2 S2 O3 0,1 mol/l Glucose, fructose, sucres invertis C6 H12 O6 Lactose C12 H22 O11 Na2 S2 O3 0,1 mol/l ml mg différence mg différence ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

J. DOSAGE DU LACTOSE

1. Objet et champ d’application

La méthode permet de déterminer la teneur en lactose des aliments pour animaux qui en contiennent plus de 0,5 %.

2. Principe

Les sucres sont dissous dans l’eau. La solution est soumise à la fermentation par la levure Saccharomyces cerevisiae qui laisse le lactose intact. Après défécation et filtration, la teneur en lactose du filtrat est déterminée par la méthode de Luff-Schoorl.

3. Réactifs

3.1.

Suspension de Saccharomyces cerevisiae: mettre en suspension 25 g de levure fraîche dans 100 ml d’eau. La suspension se conserve une semaine au maximum au réfrigérateur.

3.2.

Solution de Carrez I: dissoudre dans l’eau 21,9 g d’acétate de zinc Zn(CH3 COO)2 2H2O et 3 g d’acide acétique glacial. Ajuster à 100 ml avec de l’eau.

3.3.

Solution de Carrez II: dissoudre dans l’eau 10,6 g de ferrocyanure de potassium K4Fe(CN)6 3H2O. Ajuster à 100 ml avec de l’eau.

3.4.

Réactif selon Luff-Schoorl: Verser, tout en agitant prudemment, la solution d’acide citrique (point 3.4.2) dans la solution de carbonate de sodium (point 3.4.3). Ajouter ensuite la solution de sulfate de cuivre (point 3.4.1) et ajuster à 1 litre avec de l’eau. Laisser reposer une nuit et filtrer. Contrôler la concentration du réactif ainsi obtenu (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/litre). Le pH de la solution doit être de 9,4 environ.

3.4.1.

Solution de sulfate de cuivre: dissoudre 25 g de sulfate de cuivre Cu SO4 5H2O, exempt de fer, dans 100 ml d’eau.

3.4.2.

Solution d’acide citrique: dissoudre 50 g d’acide citrique C6H8O7 • H2O dans 50 ml d’eau.

3.4.3.

Solution de carbonate de sodium: dissoudre 143,8 g de carbonate de sodium anhydre dans environ 300 ml d’eau chaude. Laisser refroidir.

3.5.

Granulés de pierre ponce bouillis dans l’acide chlorhydrique, lavés à l’eau et séchés.

3.6.

Solution à 30 % (p/v) d’iodure de potassium.

3.7.

Acide sulfurique 3 mol/l.

3.8.

Solution de thiosulfate de sodium 0,1 mol/l.

3.9.

Solution d’amidon: ajouter un mélange de 5 g d’amidon soluble dans 30 ml d’eau à 1 litre d’eau bouillante. Faire bouillir durant 3 minutes, laisser refroidir et ajouter, si nécessaire, 10 mg d’iodure mercurique comme agent conservateur.

4. Appareillage

Bain d’eau muni d’un thermostat réglé à 38-40 °C.

5. Mode opératoire

Peser, à 1 mg près, 1 g de l’échantillon et introduire cette prise d’essai dans une fiole jaugée de 100 ml. Ajouter 25 à 30 ml d’eau. Placer le ballon pendant 30 minutes dans un bain d’eau bouillante et refroidir ensuite à 35 °C environ. Ajouter 5 ml de suspension de levure (point 3.1) et homogénéiser. Laisser reposer la fiole durant 2 heures dans un bain d’eau, à la température de 38 à 40 °C. Refroidir jusqu’à 20 °C environ.

Ajouter 2,5 ml de solution de Carrez I (point 3.2) et agiter pendant 30 secondes; ajouter ensuite 2,5 ml de solution de Carrez II (point 3.3) et agiter de nouveau pendant 30 secondes. Ajuster à 100 ml avec de l’eau, mélanger et filtrer. Prélever à la pipette une quantité de filtrat n’excédant pas 25 ml et contenant de préférence 40 à 80 mg de lactose et introduire celle-ci dans un erlenmeyer de 300 ml. Si nécessaire, ajuster à 25 ml avec de l’eau.

Procéder de la même façon à un essai à blanc avec 5 ml de suspension de levure (point 3.1). Déterminer comme suit la teneur en lactose selon Luff-Schoorl: ajouter 25 ml exactement du réactif selon Luff-Schoorl (point 3.4) et deux granulés de pierre ponce (point 3.5). Chauffer, en agitant à la main, sur une flamme libre de hauteur moyenne et porter le liquide à ébullition en 2 minutes environ. Placer immédiatement l’erlenmeyer sur une toile métallique pourvue d’un écran d’amiante muni d’un trou de 6 cm environ de diamètre, sous laquelle on a préalablement allumé une flamme. Celle-ci est réglée de façon que seul le fond de l’erlenmeyer soit chauffé. Adapter ensuite un réfrigérant à reflux sur l’erlenmeyer. À partir de ce moment, faire bouillir pendant 10 minutes exactement. Refroidir immédiatement dans l’eau froide et après 5 minutes environ, titrer comme suit:

Ajouter 10 ml de solution d’iodure de potassium (point 3.6) et, immédiatement après et avec prudence (en raison du risque de formation d’une mousse abondante), 25 ml d’acide sulfurique (point 3.7). Titrer ensuite par la solution de thiosulfate de sodium (point 3.8) jusqu’à apparition d’une coloration jaune terne, ajouter l’indicateur à l’amidon (point 3.9) et achever le titrage.

Effectuer le même titrage sur un mélange exactement mesuré de 25 ml de réactif selon Luff-Schoorl (point 3.4) et 25 ml d’eau, après avoir ajouté 10 ml de solution d’iodure de potassium (point 3.6) et 25 ml d’acide sulfurique (point 3.7), sans porter à ébullition.

6. Calcul des résultats

Déterminer, à l’aide de la table jointe, la quantité de lactose (en mg) qui correspond à la différence entre les résultats des deux titrages, exprimés en ml de thiosulfate de sodium 0,1 mol/l.

Exprimer le résultat sous forme de pourcentage de lactose anhydre dans l’échantillon.

7. Observation

1.

Pour les produits contenant plus de 40 % de sucres fermentescibles, utiliser plus de 5 ml de suspension de levure (point 3.1).

2.

Dans les aliments “à teneur réduite en lactose” (le lait pour chat, par exemple), le lactose est converti en fructose, qui n’est pas entièrement fermenté dans les 2 heures, ce qui donne des résultats supérieurs ou de faux positifs (à cause des résidus de fructose restant dans l’extrait). Table des valeurs pour 25 ml de réactif selon Luff-Schoorl ml de Na2 S2 O3 0,1 mol/l, 2 minutes de chauffage, 10 minutes d’ébullition Documents similaires Règlement32023R2745R(01) Rectificatif au règlement d’exécution (UE) 2023/2745 de la Commission du 8 décembre 2023 portant modalités d’application du règlement (UE) 2022/2379 du Parlement européen et du Conseil en ce qui concerne les statistiques sur la production animale (JO L, 2023/90838, 11.12.2023) 31/12/2024 Règlement32023R0137R(04) Règlement (UE) 2023/137 31/12/2024 Règlement32024R2733R(01) Règlement (UE) 2024/2733 27/12/2024 Règlement32022R1092R(01) Règlement (UE) 2022/1092 23/12/2024 ← Retour au droit européenVoir aussi sur EUR-Lex →